MS2 介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究-61

1/1MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究董艳美1，张国广1,2，汪卫1，范红军3，陈亮*(1厦门大学生命科学学院，福建厦门,361005;2漳州师范学院生命科学与技术系，福建漳州,363000;3河南师范大学生命科学学院，河南新乡,453000)摘要:研究表明口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）的VP1蛋白含有关键的抗原决定簇。

根据O型HLJOC12/03猪源口蹄疫病毒（FMDV）毒株VP1上第141-160位氨基酸序列设计引物，利用重叠延伸PCR（SOEPCR）技术将该序列插入在大肠杆菌噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点。

然后连接到原核表达载体pET28a上，构建了重组表达质粒28a-CP-VP1，转化BL21（DE3），ITPG诱导表达得到融合表达的CP-VP1。

透射电子显微镜下观察融合蛋白CP-VP1成类病毒颗粒（Virus-likeparticles,VLPs）状。

间接ELISA实验证实该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型口蹄疫病毒的阳性血清，30g的CP-VP1类病毒颗粒蛋白免疫小鼠后可以诱导其产生了高效价的特异的抗体。

故该口蹄疫病毒抗原决定簇展示在噬菌体MS2上表面的类病毒颗粒蛋白具有开发成口蹄疫疫苗的前景。

关键词:口蹄疫；MS2噬菌体；抗原决定簇；类病毒颗粒中图分类号：

Q78文献标识码：

Ａ文章编号口蹄疫（Foot-and-mouthdisease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）引起的危害牛、猪、羊、骆驼、鹿、牦牛等约70种家畜及野生偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病[1-5]。

因为其一旦爆发则传播速度快,流行范围广，补救措施少，可造成上百亿美元的直接经济损失，故被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，我国规定其为一类动物疾病[1,5]。

FMDV为单股正链RNA病毒，主要有7个血清型[6,7]，近年来，爆发流行于我国境内的大都是O型，A型和AsiaI型[5]。

自缅甸98（MYA98）谱系口蹄疫病毒2010年2月在我国广州白云区疫区首次发现以来，该病毒已经持续地给我国多省的畜牧业造成了巨大的损失，并且该病毒在不同宿主变异较大。

虽然传统的灭活疫苗的免疫原性比较好，也在口蹄疫疫情的控制和在动物保护上发挥了极其重要的作用,但是，灭活苗在生产过程中不仅要求严格，且存在安全隐患的问题[8,9]；并且免疫动物和感染收稿日期：

2012-11-07基金项目：

厦门市科技计划项目(NO.3502Z20103007)，福建省科技厅重点项目(NO.2009N0051)和福建省自然科学基金(NO.2010J01240)资助作者简介：

董艳美(1981-)，女，博士研究生．E-mail：

diy1129@163.com.研究方向：

口蹄疫疫苗*通讯作者：

陈亮，男，教授，博导，E-mail：

chenlg@FMDV的动物无法很好区分，限制了动物产品的出口；此外，灭活苗的有效期较短，诸如此类的缺陷使得寻找更安全稳定的新型疫苗成了科学工作者的大方向[3,10-12]。

与传统疫苗相比，基因工程疫苗是一类非常安全高效的疫苗。

大肠杆菌MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3659bp，编码成熟酶蛋白（或A蛋白）、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子[13,14]。

研究发现，体外将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因以及包含基因调节元件的5非编码序列的基因克隆到表达载体中，诱导表达后的蛋白可自我组装为成熟的类病毒颗粒[15,16]，且在其外壳蛋白基因的特定位点处插入几个基因可以表达成外源氨基酸展示的类病毒颗粒状[17,18]，以此，我们可以开发出类病毒颗粒疫苗。

类病毒颗粒疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，其具有强大的免疫优势：

表面结构规则，大小合适，易于被免疫系统识别并产生很好的免疫效果；在血清中的半衰期较长等等[19]。

本项研究选择了O/HLJOC12/03毒株口蹄疫病毒VP1蛋白上关键的抗原决定簇第141-160位氨基酸[1,10,20]对应的核苷酸序列，利用SOEPCR插入到MS2噬菌体的外壳蛋白基因的特定位点，经过大肠杆菌诱导表达出O/HLJOC12/03口蹄疫病毒的抗原决定簇多肽表达展示在MS2病毒样颗粒的表面的类病毒颗粒。

体外和体内的免疫学实验都证实该类病毒颗粒蛋白可以很好地诱导被免疫的小鼠产生特异的抗体，且具有很好的免疫原性。

本项实验研究结果为进一步开发出新型的口蹄疫类病毒颗粒疫苗提供了实验依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1菌株、质粒和主要试剂：

BL21（DE3）表达菌株，为本实验室保存，质粒pMS27（包含有大肠杆菌噬菌体MS2的结构基因序列）[21]由美国新墨西哥大学的DavidS.Peabody教授惠赠。

限制性内切酶BamHⅠ和NheⅠ酶，氨苄青霉素、卡纳霉素等抗生素及Taq酶，T4连接酶，dNTPs和克隆载体pMD18-TSimpleVector等购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；DNAMarker和ProteinMarker购自北京天为时代科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；5蛋白缓冲液、SDS配制溶液、磷酸盐缓冲液和电转缓冲液等均按分子克隆实验指南[22]进行配制。

1.1.2实验动物、阳性血清：

实验选用的15只20g左右的健康清洁级的BAL（B/C）小鼠购自厦门大学实验动物中心；O型FMDV抗原和豚鼠的阳性血清等购自中国农科院兰州兽医研究所；辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠的IgG抗体购自成都的杰华科技有限公司。

1.1.3引物：

根据pMS27序列设计的扩增出能够自我组装的MS2的5非编码区、成熟酶基因、外壳蛋白基因的序列的引物为U-CP和D-CP。

引物序列见表1。

根据网站plexedwithaneutralizingantibody:directinvolvementoftheArg-Gly-Aspmotifintheinteraction.TheEMBOJ,1995,14(8):1690-1696.[26]DiMarchiR,BrookeG,GaleC,etal.Protectionofcattleagainstfoot-and-mouthdiseasebyasyntheticpeptide.Science,1986,232:639-641.[27]MorganD,MooreD.ProtectionofcattleandswineagainstFoot-and-mouthdiseaseusingbiosyntheticpeptidevaccines.AmJVetRes,1990,51:40-45.[28]LiGJ,ChenWZ,YanWY,etal.Comparisonofimmuneresponsesagainstfoot-and-mouthdiseasevirusinducedbyfusionproteinsusingtheswineIgGheavychainconstantregionor-galactosidaseasacarrierofimmunogenicepitopes[J].Virology,2004,328:274-281.[29]ZhangQ,LiLX,YanAG,etal.Immunogenicityofarecombinantfusionproteinoftandemrepeatepitopesoffoot-and-mouthdiseasevirustypeAsia1forguineapigs[J].ActaVirol,2002,46:1-9.[30]SubramanianBM,MadhanmohanM,SriramanR,etal.Developmentoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)serotypeOvirus-like-particles(VLPs)vaccineandevaluationofitspotency.ANTIVIRRES,2012,96(3):288-295.StudyonMS2mediatedviruslikeparticlesVaccineagainstFMDV1,GuoguangZhang1,2,WeiWang1,HongjunFan3,LiangYanmeiDongChen*1ThekeyLaboratoryofministryofEducationforCellbiologyandTumorCellEngineering,schoolofLifesciences,XiamenUniversity,Xiamen,Fujian,3610052Departmentofbiologicalscienceandtechnology,ZhangzhouNormalUniversity,Zhangzhou,Fujian,3630003SchoolofLifesciences,HenanNormalUniversity,Henan,Xinxiang,453000Abstract:Foot-and-mouthdisease(FMD)hascausedsevereeconomiclossestomillionsoffarmersinmanycountriesallovertheworld.Theseverityofthediseaseandthespreadofthisepidemicvirushavenotbeencontrolledfruitfully,anditcontinuestobeathreattolivestock.Vaccinationisoneofthemosteffectiveweaponsagainsttheinfectiousdisease.Ourstudywasaimedtodevelopakindofeffectiveandsafeviruslikeparticles(VLPs)vaccine.VP1proteinoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)haskeyantigenicdeterminantswhichwereusedbyvaccinedeveloperstimeandagain.Thenucleotidescodingthepeptidesfrom141to160AAofVP1proteinofstrainHLJOC12/03FMDVwereamplifiedandinsertedintothespecificsiteinthecoatproteingeneofMS2byusingSOEPCR.TheproductsweredigestedbyenzymesandthenligatedtothepET28a.Therecombination