微生物的选择培养和计数 教学课件

微生物的选择培养和计数微生物的选择培养和计数选择培养基1微生物的选择培养2微生物的数量测定3一、选择培养基资料1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增的DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）。为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？这是因为水生栖热菌能在70~80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。美国黄石国家公园的一个热泉选择培养基1.定义在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基，称为选择培养基。2.原理

人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。3.方法①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。③改变微生物的培养条件。例如，用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物；将pH调至酸性分离耐酸菌。

思考讨论：选择培养基配方的设计尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。尿素分子模型讨论1：如果让你配置一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？讨论2：

该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？讨论1：如果让你配置一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖。讨论2：该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml配方一：培养细菌配方二：培养可以分解尿素的细菌（1）从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？固体培养基。配方二是以尿素作唯一氮源的选择培养基（2）此培养基中共有哪些成分？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：配方二氮源：成分：碳源、氮源、水、无机盐二、微生物的选择培养

由于土壤中细菌数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上——稀释涂布平板法。将菌液进行一系列的梯度稀释，将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。1、方法—稀释涂布平板法（1）铲取土样，将样品装入纸袋。2.操作步骤：（2）将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。（3）从试管中取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。取0.1ml菌液，滴加到培养基表面。（4）将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿,使涂布均匀。将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽，涂布器冷却后，再进行涂布。将涂布器放在盛有酒精的烧杯中。注意事项：①10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略；②由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；③过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；④将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。（1）培养细菌待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。（2）观察结果在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。3.培养与观察恒温培养箱两种纯培养方法的比较平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具单菌落的获得用途接种效果图相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的梯度稀释，将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，培养得到单菌落接种环涂布器从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的三、微生物的数量测定稀释涂布平板法、显微镜直接计数微生物的数量测定1.稀释涂布平板法——间接计数法（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能测出样品中大约含有多少活菌。（2）计数原则①一般选择菌落数为30~300的平板进行计数。②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。③适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。思考讨论为什么要选择菌落数在30~300的平板进行计数？保证结果的准确性。

若菌落数太少，数据之间的误差通过乘以稀释倍数放大就会造成更大的误差。若菌落数过多，菌落会互相连成一片，难以计数，而且菌落之间竞争养分，影响细胞的生长和增殖，也会极大的影响实验结果。（3）结果分析：①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。②统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。（4）计算公式：C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)M代表稀释倍数每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M2.显微镜直接计数——直接计数法（1）方法：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。①血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。②细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（2）优点：快速直观（3）结果分析：统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌和活菌。计数方法比较内容直接计数法间接计数法主要