SARS动物感染模型-(1)课件

SARS动物感染模型组员：陈彤彤、胡珣、李玉瑶点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本SARS？重症急性呼吸综合征（SARS）为一种由SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起的急性呼吸道传染病。临床表现为发热,咳嗽,呼吸窘迫。该疾病传染性强，

病死率高，大量病人死于呼吸衰竭，且出现肺纤维化及股骨头坏死并发症。主要传播方式为近距离飞沫传播或接触患者呼吸道分泌物。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本SARS动物感染模型的建立筛选动物种类，确定敏感动物。标化一定剂量感染性病原。经适当途径感染指定的动物。记录临床表现，确定和检测特征性指标。评价模型点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本筛选动物种类，确定敏感动物恒河猴，别名猕猴、黄猴、广西猴。是我国常见的一种猴类,分布地域范围十分广泛。适应性强，容易驯养繁殖，生理上与人类较接近，因此是生物学、心理学、医学等多种学科研究工作中比较理想的试验动物。恒河猴标化病原点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本病原体选取原则模型制备使用的病原体应处于活化状态的最好病原（实验室研究在培养48小时以后，到达顶峰，此时活性最好）导致相同感染性疾病的病原在不同地区存在差异，致病性也会不同，因此，应选择生物学特性明确，经过鉴定的标准株进行模型研究。SARSCoVNS—I株选择感染途径点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本SARS主要传播方式为近距离飞沫传播或接触患者呼吸道分泌物选择经鼻吸入感染SARS病毒方法制作SARS感染的模型特征性指标的确定和检测点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本临床表现病原学指标病理生理性指标免疫学指标1.体温:检测体温是否升高，正常猴体温38℃。2.病毒分离培养：观察细胞是否病变。3.病理检查：取处死后的恒河猴组织，常规病理固定，HE染色，光镜下观察。4.病毒核酸检测：在特定区域处出现特异性核酸扩增带者为阳性，反之阴性。5.间接免疫荧光检测:加FITC羊抗人IgG荧光抗体，在荧光显微镜下观察染色结果，胞浆或胞膜上出现翠绿色荧光者为阳性，桔红色者为阴性。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本恒河猴感染SARS病毒致病模型的建立点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本实验材料的准备1.SARSCoVNS—I株，为国家认可的SARSCoY标准株，由北京华特森基因科技有限公司提供。2.Vero细胞(163代)由武汉大学典型物保存中心提供，培养用MEM培养基+10％小牛血清，常规加入青、链霉素(自配)。3.普通恒河猴(MacacaRhesus)12只，2～3岁，约5kg左右，雌雄各半。健康良好，SARSCoVIgG检测阴性，购自云南省动物繁殖中心。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本动物分组和病毒感染1.设病毒感染组和非病毒感染组各6只恒河猴。2.猴笼保持空气新鲜，维持相对湿度60％，温度(2O±5)℃。3.感染部位常规消毒后，将病毒用注射器经气管软骨气管内滴注，病毒滴度为10PFU／mL，感染剂量为0.5mL／只。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本

病毒分离1.恒河猴感染病毒后，第2、5d分别静脉采血2—3mL(不抗凝)；第3、5、7、9d采集鼻咽拭子和肛拭子，并置于1mL生理盐水中；第1d后隔日采集尿液；上述标本存4℃。2.第10d各处死3只恒河猴及第14d各处死另3只恒河猴，并取肺组织存一3O℃。3.病毒感染前分别留血液、鼻咽拭子、肛拭子和尿液作为对照。4.病毒分离程序为：将组织制成10％匀浆或分泌物离心上清，取0．2mL／孔，接种到已长成单层的24孔细胞培养板内，每份标本接种4孔，37℃、5％CO2培养，观察细胞病变，未病变标本盲传3代并作间接免疫荧光检测。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本

病理检查取处死后恒河猴的肺、肝、肾、脾、心脏和脑组织，常规病理固定、HE染色，光镜下观察。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本

病毒核酸检测1.提取RNA的过程：上述病毒分离材料(包括SARSCoVNS-I株)用TRIzolRNA抽提试剂(Invitrogen生命公司)抽提RNA，所提RNA溶于20uL无RNA酶的水中备用。2.逆转录过程为：组织RNA或SARSCoVNS一1株RNA4uL,加Oligo(dT)(0.5ug／uL)2uL补水至10.5uL，65℃变性10min，后立即至冰浴，依次加入5×逆转录缓冲液4uL、0.1mol／LDTT2uL、0.01mol／LdNTP2uL、RNasin(40U／uL)0．5uL及AMV(5U／pL)1uL，43℃水浴1h，后立即至冰浴。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本

病毒核酸检测3.PCR扩增的过程：取cDNA5uL、10xTaq酶缓冲液5uL、dNTPs(0.01mol/L)2uL、引物1，2各1(序列见下)、Taq酶(2U／uL)1uL，补水至总体积50uL进行PCR扩增，反应参数为：94℃2min;94℃10s/55℃30s／68℃3min，共10个循环；94℃10s／55℃30s／68℃3min，共25个循环，后68℃7min延伸。引物序列为：5’CAGAGT-FGTGG1TCAAGTG3’(21431-21450)5’CACAGAGTAATCAGCAACAC3’(22538-22519)4.凝胶电泳的过程：反应产物经含EB的1％琼脂糖凝胶电泳检测，在1．1kb处出现特异性核酸扩增带者为阳性，反之阴性。正常组织、病毒标准株分别作阴阳性对照。点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本间接荧光免疫检测1.感染细胞滴片晾干，冷丙酮固定30min。2.将己灭活的传染性非典型性肺炎的恢复期病人血清标本适当稀释后分别滴加到细胞抗原片上，置37℃湿盒中孵育30min，冲洗，PBS液中振荡洗3次，晾干。3.然后加FITC羊抗人IgG荧光抗体，同前常规孵育、冲洗、晾干并封片，在荧光显微镜下观察染色结果。4.胞浆或胞膜上出现翠绿色荧光者为阳性，桔红色者为阴性。恒河猴SARS感染模型完成点击添加文本点击添加文本点击添加文本点击添加文本恒河猴