MAPK信号通路presentation课件

MAPK信号通路presentation内容概要研究背景研究思路及核心技术创新点展望内容概要研究背景研究思路及核心技术创新点1.1阿尔茨海默症（Alzheimer'sdisease,AD）1906年报道1例51岁女性患者，进行性记忆和语言能力丧失及识别能力障碍，病情逐渐恶化、4年半后死亡，病解发现脑萎缩、老年斑和神经原纤维改变。65-6970-7475-7980-8485-8990-9495-99年龄(年)4病理特征：β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经元纤维缠结。老年斑神经元纤维缠结51.2淀粉样蛋白级联假说AmyloidcascadehypothesisneurodegenerationFomationofbrainoligomericAβordepositionoffibrillarAβaccumulationAmyoidprecursorprotein(APP)Pathogenesis：increased，alteredproductionorreducedclearanceofAβhereditaryfactorenvironmentalfactorβ-secretaseγ-secretaseAβ（observedinthebrainofpatientswithADADandSAD）APP淀粉样前体蛋白Aβ淀粉样多肽β-secretaseβ分泌酶γ-secretaseγ分泌酶6APPC83APP水解途径非淀粉样途径：被α-分泌酶（C83）和γ-分泌酶连续切割淀粉样途径：Aβ的产生，被β-分泌酶（C99）（670Met～671Asp之间）和γ分泌酶依次切割APP是一种跨膜蛋白质,在体内各种组织广泛存在,而在脑组织的表达最高。APP水解途径β分泌酶水解670Met～671Asp之间的肽键，将APP一分为二，生成670个氨基酸的APP片段和带完整Aβ的跨膜C段。非淀粉样途径：被α-分泌酶（C83）和γ-分泌酶连续切割淀粉样途径：Aβ的产生，被β-分泌酶（C99）和γ分泌酶依次切割8课题选取的5个APP突变选取理由：2个早期发现突变E693G和E693Q，剩余3个为近些年发现的突变。对比研究。内容概要研究背景研究思路及核心技术创新点展望表征：APPlevelC99levelAβlevel本课题选取5个APP突变，研究不同APP突变对Aβ形成过程的不同作用2.1研究出发点2.2.1构建BACE1稳转HEK293细胞株2.2.2突变构2.2.3转染2.2.4检测建APP突变基因真核表达载体构建APP突变基因真核表达载体2.2设计思路及核心技术2.2.1构建BACE1稳转HEK293细胞株2.2.2突变构2.2.3转染2.2.4检测建APP突变基因真核表达载体构建APP突变基因真核表达载体2.2设计思路及核心技术2.2.1构建BACE1稳转HEK293细胞株2.2.2突变构2.2.3转染2.2.4检测建APP突变基因真核表达载体构建APP突变基因真核表达载体2.2设计思路及核心技术APP基因序列重叠延伸法PCR引入突变位点pcDNA4A+BC+D

采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。重叠延伸PCR在基因的定点突变中具有重要应用。引物设计重叠延伸法PCR结果突变及检验MarkerⅢDNALadder2.3kb双酶切结果5.0kb2.1kbA673TA673VE682KE693GE693QAPPWTA673TA673VE682KE693GE693QpcDNA420双酶切验证结果成功构建5个APP突变基因真核表达载体。野生APP基因约为2.3kb，pcDNA4为5.1kb，选用内切酶为HindⅢ和XbaⅠ，下图为琼脂糖凝胶电泳结果（酶切后两片段约为2.1kb和5.0kb）：重组检验自左向右：1为Maker；2、3为APPA673T；4、5为APPA673V;6、7为APPE682K;8、9为APPE693G;10、11为APPE693Q。其中，2、3、4、6、7、8、9、10、11为阳性结果。说明成功构建APP突变基因真核表达系统。2.2.1构建BACE1稳转HEK293细胞株2.2.2突变构2.2.3转染2.2.4检测建APP突变基因真核表达载体构建APP突变基因真核表达载体2.2设计思路及核心技术脂质体介导瞬时转染2.2.1构建BACE1稳转HEK293细胞株2.2.2突变构2.2.3转染2.2.4检测

建APP突变基因真核表达载体构建APP突变基因真核表达载体2.2设计思路及核心技术检测APP、C99和AβWesternBlot、ELlSA、质谱APPC83APP水解途径非淀粉样途径：被α-分泌酶（→C83）和γ-分泌酶连续切割淀粉样途径：Aβ的产生，被β-分泌酶（670Met～671Asp之间）（→C99）和