保健食品的微生物限度检验方法验证浅析省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

保健食品微生物程度

检验方法验证浅析

第1页引言伴随国民生活水平提升，人们对生活质量也有了较高要求，防病于未然健康意识逐步被人们所重视，保健食品随之成为人们脱离亚健康路径之一。我国保健食品概念是1996年《保健食品管理方法》中“标明含有特定保健功效食品。即适宜于特定人群食用，含有调整机体功效，不以治疗疾病为目标食品”。含有三种属性：食品属性；功效属性(含有特定功效)；非药品属性。然而劣质保健食品不但不能提升人们生活质量，甚至威胁生命安全，因而保健食品安全评价及质量检验是确保人们使用合格产品前提。第2页保健食品质量安全包含两方面内容：不以传统食品为载体保健食品含有其特有安全问题。以传统食品为载体，要考虑对应食品安全问题，如以植物为起源传统食品当考虑农残、植物生长刺激素等；以动物为起源则应考虑抗生素、激素等。但同时作为保健食品特有质量安全问题，还须高度关注保健食品中加入化学药品（如违法添加芬氟拉明、麻黄素或速尿减肥产品；又如一些“补品”检出了枸橼酸西地那非，即伟哥主成份），各种功效成份/提取物内源性毒物安全（如中草药毒性及长久服用安全性评价），新资源、新技术、功效性安全，进口保健食品，伪劣保健食品，非法添加物检验等问题。第3页鉴于保健食品于近年来暴露出一些质量问题，中检所和药检处统一布署，扩大我所检验范围，开展对保健食品质量监督检验工作，微生物程度作为食品药品必检项目，显示其基础安全主要性。我室于、06年进行了保健食品卫生微生物学程度检验及方法学验证试验工作，完成了30各种购置样品试检验任务，以及几个注册品种检验，包括口服液、片剂、胶囊、茶剂等常见保健食品类型，结合食品国家标准和药典探讨保健食品检验方法及可行性，现对有检验情况汇报以下，供检验部门参考。第4页摘要我所按中国药典版微生物程度法及方法学验证法，对32种保健食品进行方法学验证，结果表明其中15个品种（活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养胶囊、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊、全虫草胶囊、再高铁儿童成长口服液、血尔口服液、瞳神牌轻亮、养颜鹿胎粉、梦玉胶囊、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片、二月红牌红润片）分别对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌有抑菌作用，染菌回收率均低于70%。结果说明：1、采取GB/T4789.1~4789.31~食品微生物程度检验法不能真实反应产品质量，因而不宜采取；2、应分别采取培养基稀释法和薄膜过滤法进行方法学验证。3、微生物程度方法学验证必要性。第5页关键词方法学验证、微生物程度、回收率、保健食品质量。第6页一、试验目标确认对保健品进行微生物程度检验时，所采取细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检验方法是否适合于该保健品微生物程度检验。第7页样品（1）天元甘露低聚果糖液0701云南绿色生物工程有限企业（2）维生素E（加州熊）040902济南生命力生物科技有限企业（3）海王金樽040712深圳市海王健康科技发展有限企业（4）神奇寿乐牌排铅冲剂040210常州市红太阳工程有限企业（5）盖中盖高钙片1207哈药集团制药六厂（6）龙希膳食纤维胶囊0718湖北恩施宏业魔芋开发有限责任企业（7）紫薇卵磷脂胶囊1119清华紫光（集团）总企业（8）吾老七羊胎美容浓缩液04092701浙江蘅州市吾老七保健品有限企业（9）脑轻松胶囊1207香港康富来国际企业有限企业（10）江中亮嗓胖大海0822云南绿生物工程有限企业（11）江中活谓素得而乐胶囊1206广州蓝钥匙海洋生物工程有限企业（12）忘不了3A脑营养1107山东禹王制药有限企业第8页（13）瞳神牌轻亮04030101北京轻尔特科技开发中心（14）再高铁儿童成长胶囊0920广州市红虹生物科技有限企业（15）血尔口服液0006香港康富来国际企业有限企业（16）金舒通胶囊0601-05武汉名实医药科技有限责任企业（17）仙牌灵芝茶0112四川仙牌灵芝集团有限企业（18）事轻松胶囊1026武汉静悟绿色保健研究所（19）养颜鹿胎粉040606广东广济堂医药保健品有限企业（20）老君舒压茶1218成都物华生物制品有限企业（21）梦玉胶囊 0102济南生命生物科技有限企业（22）心态好（天一美乐宁片）031201北京乐宁科技有限责任企业（23）华济堂牌护肝灵胶囊0517美国德全高科技药业05210525第9页（24）前烈立舒胶囊QLS05222香港奥美制药厂（25）二月红牌红润片042425050中天(上海)营养食品有限企业（26）绅宁宝胶囊0220、0225香港康恩堂制药有限企业（27）博士伦博视康牌叶黄素片1515、1525、1535德国博士曼大药厂（28）全虫草胶囊210西藏天知生物科技开发有限企业（29）觉父胶囊0307、0327香港奥美制药厂（30）苦瓜精华素片3117、3500美国GSL科技有限企业（31）宁烈宁胶囊0428、0509香港奥美制药厂（32）富威牌剑影胶囊021333北京富威生物科技开发企业第10页二、培养基胆盐乳糖增菌液批号：040324玫瑰红钠琼脂批号：050316营养琼脂批号：050310营养肉汤批号：041010改良马丁琼脂批号：050520改良马丁琼脂液体批号：040302曙红亚甲蓝琼脂批号：040413葡萄糖肉浸液肉汤批号：040902EMB批号：040413麦康凯批号：050608血营养琼脂批号：050310沙门、志贺菌属琼脂批号：050121胰酪胨大豆肉汤批号：050422DHL批号：0501274-甲基伞形酮葡萄糖苷(MUG)050127GN批号：040224四硫酸钠煌绿增菌液TTB批号：040413以上培养基均由中国药品生物制品检定所提供，另由本室本室自行配制胆盐乳糖增菌液（小倒管）10ml。第11页三、菌种枯草杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(F)44102]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]弗氏志贺菌（Shigellaflexneri）[CMCC(F)51573]乙型溶血性链球菌（β－Hemolyticstreptococcus）[CMCC(F)32210]沙门氏菌（Salmonellaparatyphi）[CMCC(B)50094]第12页四、方法验证1、菌液制备：（1）取经37℃培养18-24小时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、乙型溶血性链球菌、福氏痢疾肉汤培养物1ml+9ml盐水10倍稀释至10-5~10-7为50~100CFU/ml，做活菌计数备用。（2）取经25℃培养18~24小时白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9ml盐水10倍稀释至10-5为50~100CFU/ml，做活菌计数备用。（3）取经25℃培养1周黑曲霉斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸收出菌液，用标准比浊管比浊，与浊度相当后，取1ml+9ml盐水=10-1，逐管10倍稀释为10-4约50~100CFU/ml，做活菌计数备用。第13页菌液检验

（1）取上述金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌、乙型溶血型链球菌、福氏痢疾菌、沙门菌10-5~10-7稀释液各1ml，用45℃营养琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，30～35℃培养48小时，计数，应约为50~100cfu/ml。（2）取上述白色念珠菌10-5~10-6稀释液及上述黑曲霉菌10-4孢子悬液各1ml，用45℃琥红琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，23～28℃培养,逐日观察计数，应约为50~100cfu/ml。第14页供试液制备称取样品10g，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液100ml浓度均为1：10供试液。第15页细菌、酵母菌及霉菌方法学验证（1）常规法：采取加1：10供试液1ml，分他人工接种上述5种阳性代表试验菌株，50~100CFU/ml，再加15~20ml琼脂培养基，待凝固后，置要求温度培养24~48小时观察结果细菌计数，测定回收率结果见表2。（2）培养基稀释法：采取加0.5ml、0.2ml、0.1ml/皿供试液，人工接种上述敏感试验菌株，再加15~20ml琼脂培养基，待凝固后，置要求温度培养24~48小时观察结果细菌计数，测定回收率。结果见表3。（3）薄膜过滤法：分别取不一样品种1：10供试液取上清夜1ml加入滤器中、用0.1%蛋白胨氯化钠稀释液冲洗300ml/滤器再加要求敏感菌株冲洗后、取出滤膜贴要求培养基培养24~72小时观察结果见表4。第16页回收率测定：（1）试验组：分别取不一样品种1：10供试液1ml、50~100CFU/ml试验菌株同时加入平皿中，马上倾注琼脂培养基，待凝固后，置要求温度培养24~72小时观察结果。薄膜过滤法以最终一次冲洗液加入试验菌。（2）活菌组：测定每一菌株加试验菌数见表1（3）供试液对照：测定供试品本底菌数（略）（4）稀释剂对照组。第17页回收率计算按以下公式计算试验组加菌回收率：第18页（三）、控制菌检验方法学验证当建立药品微生物检验法时，应进行控制菌方法学验证，以确认所采取方法适合于该药品控制菌检验（1）试验组取1：10供试液，接入100ml/瓶5瓶胆盐乳糖增菌培养基和3瓶亚碲酸盐肉汤增菌培养基中，（10ml供试液/瓶）其中1瓶接种大肠埃希菌、福氏痢疾、沙门菌供试液瓶、稀释剂对照组瓶；其中1瓶接种乙型溶血性链球菌、供试液瓶、置35培养经24~48小时结果见表5。第19页（2）阴性菌对照组a取金黄色葡萄球菌50~100cfu/ml，接种胆盐乳糖增菌培养基中，置35培养经24~48小时，阴性菌对照菌组为阴性（未生长）。b取大肠埃希菌50~100cfu/ml，接种亚酸盐肉汤增菌培养基中置35培养经24~48小时，阴性菌对照菌组为阴性（未生长）。第20页五、结果菌落计数

表1菌落计数试验次数金葡菌10-6枯草杆菌10-5白色念珠菌10-5黑曲霉10-4大肠杆菌10-6126、2617、1336、35128、129134、151283、8616、2526、2494、9839、44378、8698、96100、110120、12660、62469、49100、102100、110128、13025、20第21页表2微生物程度检验法验证常规法接种阳性菌株回收率（%）序号供试品金葡菌枯草杆菌大肠杆菌白色念珠菌黑曲霉菌1天元甘露低聚果糖液100.080.0100.094.2100.02维生素E（加州熊）97.070.795.2100.0100.03海王金樽100.070.775.9100.090.64神奇寿乐牌排铅冲剂98.895.187.9100.0100.05盖中盖高钙片100.0100.087.799.187.46龙希膳食纤维胶囊100.0100.0100.094.282.97紫薇卵磷脂胶囊100.0100.0100.0100.095.48吾老七羊胎美容浓缩液100.0100.0100.087.6100.09脑轻松胶囊100.0100.0100.079.1100.010江中亮嗓胖大海100.0100.073.896.5100.011活谓素得而乐胶囊55.1100.0100.085.2100.012忘不了3A脑营养0.0100.093.373.3100.013瞳神牌轻亮88.80.090.4100.0100.014再高铁童少儿成长口服液100.046.381.9100.0100.015血尔口服液73.20.091.898.1100.0第22页序号供试品金葡菌枯草杆菌大肠杆菌白色念珠菌黑曲霉菌16金舒通胶囊100.036.792.3100.095.417仙牌灵芝茶74.630.080.8100.096.518事轻松胶囊100.053.376.988.790.519养颜鹿胎粉85.20.061.4100.085.420老舒君压茶85.7100.095.994.287.621梦玉胶囊0.014.086.5100.0100.022心态好（天一美乐宁片）100.085.2100.0100.091.823华济堂牌护肝灵胶囊0.0//100.0100.024前烈立舒胶囊100.0100.071.4100.0100.025二月红牌红润片52.5100.076.477.680.226绅宁宝胶囊0.00.0100.0100.089.727博士伦博视康牌叶黄素片0.00.00.085.286.528全虫草胶囊77.765.488.2100.0100.029觉父胶囊30苦瓜精华素片73.4100.0100.095.572.231宁烈宁胶囊32富威牌剑影胶囊100.0100.066.287.872.9第23页注：23~31为年检验，控制菌全部按国家标准GB/T4789.1~4789.31~食品卫生微生物学检验方法进行检验从表2结果中能够看出：32个品种分别接种5株代表菌，有16个品种回收率均超出70%，可采取常规方法进行测定；另16个品种（活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养、再高铁儿童成长口服液、血尔口服液、瞳神牌轻亮、养颜鹿胎粉、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、梦玉胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊、二月红牌红润片、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片、全虫草胶囊）分别对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌有抑菌作用，染菌回收率%均低于70%，应分别采取培养基稀释法和薄膜过滤法进行方法学验证。第24页供试品金葡菌10-6枯草杆菌10-5大肠杆菌10-6忘不了3A脑营养82.4常规法已经过常规法已经过活谓素得而乐胶囊82.6常规法已经过常规法已经过再高铁儿童成长口服液常规法已经过40.6常规法已经过养颜鹿胎粉常规法已经过38.2/金舒通胶囊常规法已经过70.2常规法已经过仙牌灵芝茶常规法已经过70.0常规法已经过事轻松胶囊常规法已经过100.0常规法已经过华济堂牌护肝灵胶囊82.975.997二月红牌红润片0.5ml/皿100.00.0、11.1常规法已经过全虫草胶囊0.5ml/皿常规法已经过85.9、92.6常规法已经过富威牌剑影胶囊0.5ml/皿常规法已经过常规法已经过100.0表3回收率小于70％品种采取培养基稀释法

（0.2-0.5ml/皿）回收率（%）

第25页从表3中结果看出活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊等6个品种采取培养基稀释法0.2ml/皿，全虫草胶囊和富威牌剑影胶囊采取培养基稀释法0.5ml/皿，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌回收率均超出70%，使细菌正常生长，可采取培养基稀释法测定。再高铁儿童成长口服液，养颜鹿胎粉经培养基稀释法（0.2ml/皿）测定，对枯草杆菌回收率仍低于70%；二月红牌红润片采取稀释法进行检测（0.5ml/皿）枯草杆菌回收率不稳定，均低于70%，故用薄膜过滤法进行方法学验证。而对回收率很低品种，血尔口服液、瞳神牌轻亮胶囊、梦玉胶囊、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片，可直接采取薄膜过滤法进行方法学验证。第26页表1—6结果

1．32个品种其中天元甘露低聚果糖液、维生素E（加州熊）、海王金樽、神奇寿乐牌排铅冲剂、新盖中盖高钙片、龙希膳食纤维胶囊、紫薇卵磷脂胶囊、吾老七羊胎美容浓缩液、脑轻松胶囊、江中亮嗓胖大海、老舒君压茶、前烈立舒胶囊、觉父胶囊、苦瓜精华素片、宁烈宁胶等16个品种可采取常规法进行试验。2.活谓素得而乐胶囊、忘不了3A脑营养胶囊、金舒通胶囊、仙牌灵芝茶、事轻松胶囊、华济堂牌护肝灵胶囊、全虫草胶囊、富威牌剑影胶囊8个品种细菌数可采取培养基稀释法测定。3.血尔口服液、养颜鹿胎粉、再高铁童少儿成长胶囊、瞳神牌轻亮、梦玉胶囊、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片和二月红牌红润片8个品种细菌数可采取薄膜过滤法测定。第27页4.年所检22个品种没有测定沙门菌，对于其它控制菌无抑菌活性，可采取常规法进行测定。年所检10个品种其控制菌检验，按照国家标准GB/T4789.1~4789.31~食品卫生微生物学检验方法测定了沙门菌，除华济堂牌护肝灵胶囊采取培养基稀释法进行测定，前烈立舒胶囊、二月红牌红润片、绅宁宝胶囊、博士伦博视康牌叶黄素片、全虫草胶囊、觉父胶囊、苦瓜精华素片、宁烈宁胶囊富威牌剑影胶囊，对霉菌、控制菌均无抑菌活性，均可采取常规法进行测定。第28页检验结果分析

当前，保健食品按国家标准GB/T4789.1~4789.31~食品卫生微生物学检验方法进行检验，该标准中仅提供了普通检验方法，并没有提供方法验证内容和要求。而保健食品中一些成份和添加剂使用往往对微生物生长含有抑制作用，仅依据国家标准（GB/T4789.1~478