海水中7种三嗪类除草剂的测定 液相色谱-串联质谱法-地方标准编制说明

《海水中7种三嗪类除草剂的测定液相色谱-串联质谱法》编制说明一、工作简况（一）任务来源2020年度地方标准制修订计划项目的通知》（鲁市监标函〔2020〕249号《海水中三嗪类除草剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》系列标准被列入地方标准制修订计划，计划编号为2020-219。本标准由山东省海洋局提出并组织实施，由山东省海洋标准化技术委员会归口。（二）起草单位、起草人及任务分工本文件由中国水产科学研究院黄海水产研究所起草制定。主要负责标准的整体性推进工作，包括标准方案的制定、标准方法的建立和标准文本的起草，并负责开展标准方法的验证、数据统计，组织专家征求意见，然后根据反馈意见对标准修改完善。2．主要起草人及任务分工主要起草人：孙晓杰、李兆新、谭志军、邢丽红、郭萌萌、孙伟红、王联珠、李风铃、丁东生、刘云龙。任务分工如下：孙晓杰：项目主持人，负责标准内容的设计、标准起草及验证工作；李兆新：项目组织者，负责项目的整体组织实施；谭志军：参与调查研究，标准整体内容设计等工作；邢丽红：参与调查研究、标准内容设计、标准起草和修改、实验室分析等工作；郭萌萌：参与调查研究、实验室分析等工作；孙伟红：参与调查研究、收集资料和标准文本的修改等王联珠：参与调查研究、收集资料和标准文本的修改等李风铃：参与调查研究、标准文本的修改等工作；丁东生：参与调查研究、标准数据验证等工作；刘云龙：参与调查研究、标准数据验证等工作。标准的制定分以下几个阶段完成。1．第一阶段制定实施方案中国水产科学研究院黄海水产研究所接到山东省市场监督管理局下达的《海水中三嗪类除草剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》标准制定任务后，立即成立了标准起草小组，2021年1月-3月，查询国内外资料库，完成有关资料、检测技术的收集，在仪器设备、试验材料方面做了充分准备，在此基础上经过反复讨论制定出标准的实施方案。2.第二阶段起草标准文本流动相种类、梯度洗脱条件确定色谱仪器参数，继而通过扫描模式、喷雾电压、离子对和碰撞能的优化确定质谱仪器参数。方法优化的重点工作是通过对海水基质大量加标试验、提取剂筛选、净化方式比对等工作，建立标准的前处理方法。在此基础上比较了标准溶液外标法、基质加标外标法和内标校正方法对目标物的回收率影响，表明内标定量校正法对所有化合物均有较高的回收率。最终优化确定方法的适用性、回收率、精密度及检出限等参数：检出限为5.0ng/L，定量限为20ng/L；西草净、西玛津、莠灭净、莠去津、扑草净、特丁净、特丁津在添加浓度5.0ng/L～500ng/L时，回收率均为70%～120%之间，相对标准偏差均小于15％，满足残留检测标准的技术要求。2022年1-3月，依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则》、GB/T20001.4-2015《标准编写规则第4部分：试验方法标准》对标准进行了编写，形成了标准征求意见稿和编制说明初稿。3.第三阶段验证标准方法2022年4月-5月，标准起草单位特委托农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心（烟台）、农业农村部黄渤海区渔业生态环境监测中心和天祥（天津）质量技术服务有限公司青岛分公司三家单位对方法进行了复核验证。验证结果表明：方法的检出限和定量限分别为5ng/L和10ng/L，所测精密度、准确度、灵敏度等指标均符合标准规定要求，适用于海水中三嗪类除草剂的测定。4.第四阶段完成征求意见2022年5月-6月，通过电子邮件方式向国家海洋监测中心、中国海洋大学、山东省海洋资源与环境研究院等单位的30余位专家发送《征求意见稿》，共收到30余位专家的共计98条。汇总各方意见并对本标准进行修改，完成了本标准的送审稿。5.第五阶段标准论证会2022年7月20日，参加山东省海洋标准化技术委员会组织的标准现场论证会，来自山东省国家标准技术审评中心、山东省生态环境监测中心、山东师范大学、中国海洋大学和青岛大学等单位的多位专家参加会议，经过标准材料的梳理及现场ppt汇报，针对标准制定过程进行讨论，后期参照标准论证会专家意见和建议对标准文本和编制说明进行修改和完善。6.第六阶段提交平台系统。2022年12月提交山东省市场监督管理局平台系统，2022年11月-2023年7月，通过主管部门5次技术审查反馈，进行格式修改和内容调整，修改形成正式的标准送审稿。7.第七阶段标准评审会。2023年9月14日，召开标准的正式评审会，由山东省海洋标准化技术委员会组织，来自山东省生态环境监测中心、中国海洋大学、山东省标准化研究院、中国科学院海洋研究所、山东省海洋科学研究院、自然资源部北海生态中心等单位的多位专家参加会议，针对标准制定过程进行讨论，后期参照专家意见和建议对标准文本和编制说明进一步修改和完善，最终形成标准报批稿。二、地方标准制定目的和意义三嗪类除草剂(Triazineherbicides)是一类含有3个氮原子的六元杂环化合物。过去30年期间，因其高效的除草效果，在世界范围内得到广泛应用。三嗪类除草剂，被不法养殖户直接用于水产养殖，清除鱼、虾、蟹、贝、海参等水体的丝状藻类（青苔）、大型草类及有害藻类。然而，该类除草剂在农业生产和水产养殖使用过程中，通过地表径流和排放进入海洋系统，水环境中残留的除草剂已然成为生态环境污染的主要来源。由于三嗪类除草剂半衰期长、难降解、毒性大，对水生生态系统和非靶标生物的安全造成严重威胁，美国和欧盟等已将其列入内分泌干扰物名单。日本针对贝类中扑草净的最大残留限量（MRL）要求，参考其他食品执行0.01mg/kg的“一律标准”，紫菜中扑草净限量为0.14～0.19mg/kg。然而包括美国、加拿大和中国等在内的多个国家仍没有海洋环境和水产品中三嗪类除草剂安全限量(MRL)的相关规定，缺乏相应的残留监管。三嗪类除草剂不仅对贝类等非靶标生物造成严重损害，而且是我国出口日本贝类产品连续14批受阻的主要原因，是继中日两国紫菜“扑草净事件”后的又一贸易争端，成为我国出口贸易新的技术壁垒，也成为国际研究的热点和管控重点。相关检测标准的制定将有助于海洋环境的安全监管，确保生态环境安全和水产品进出口贸易的顺利开展。西玛津（Simazine）西草净（Simetryne）莠去津（Atrazine）莠灭净（Ametryn）特丁津（Terbuthylazine）扑草净（Prometryn）特丁净（Terbutryn）图1西玛津、西草净、莠去津、莠灭净、特丁津、扑草净以及特丁净的结构示意图目前，国内适用于食品基质的色谱质谱检测法，包括《GB/T18629-2002食品中扑草净残留量的测定方法》、《SN/T1968-2007进出口食品中扑草净残留量检测方法》检测对象是蔬菜、水果和粮食等食品，均不适用于海水基质。水中三嗪类检测的国内标准有《HY/T147.1-2013海洋监测技术规程》和《GB/T21925-2008水中除草剂残留测定液相色谱/质谱法》，涉及的方法仅限于气相色谱质谱法和液相色谱质谱法的外标定量，方法操作复杂、灵敏度和准确度都较低，检出限为5-250ng/L，极大影响了海洋环境监管和水产品进出口贸易的顺利开展。因此，迫切需要建立海水中三嗪类除草剂的高通量、高灵敏检测标准。本项目将建立准确、高效并易于普及的海水中三嗪类除草剂测定的液相色谱-串联质谱法。新制定标准将做以下制定：共检测西玛津（Simazine）、西草净（Simetryne）、（Terbuthylazine）、扑草净（Prometryn）以及特丁净（Terbutryn）等7种三嗪类除草剂。通过优化样品前处理方法和质谱仪器方法，采用内标法定量，所有组分检出限不高于5.0ng/L。不仅可以为我国海洋环境保护和监管事业提供技术支持，更能进一步了解我国海洋中的污染现状，保障国家海洋环境的可持续发展和生态稳定，确保我国水产品质量安全和进出口贸易的顺利开展，对树立我国海洋环境和食品安全形象至关重要。在该项目的支持下，我们已经完成了海水中三嗪类除草剂液质联用检测方法的开发工作。三、地方标准编制原则、主要技术内容和确定依据（一）标准编制原则本标准制定的主要原则，一是标准具有适用性，适用于海洋中三嗪类除草剂的污染监测，为评估海洋污染提供技术基础；二是标准具有科学性和可操作性，能够确保海洋环境保护和监管工作的准确性；三是标准具有先进性，与先进国家的标准相接轨，确保标准的先进性；四是标准具有规范性，本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，符合标准化文件的结构、起草原则和表述规则、编排格式。（二）标准主要技术内容和确定依据1.标准适用范围的确定山东省是农业和水产养殖大省，扑草净、西玛津、莠去津、特丁津、莠灭净和特丁净等是世界农化网中文网报道在我国使用最多的三嗪类农用除草剂，扑草净在国内水产养殖中可作为水质改良剂用于水体中有害藻类的清除，其在海参和贝类中检出率较高。因此，最终确定莠去津、扑草净、西草净、西玛津、莠灭净、特丁净和特丁津等7种三嗪类除草剂作为主要的监控对象。通过提取溶剂、提取方式、盐度影响、定量方式比较，在满足精密度、准确度和灵敏度的基础上，确定本文件适用于海水中莠去津、扑草净、西草净、西玛津、莠灭净、特丁净和特丁津等三嗪类除草剂的测定。2．方法原理的确定根据目标物的极性，通过优化提取方式和提取溶剂，确定二氯甲烷液液萃取的提取方案，并通过内标定量校正法确定7种化合物均具有合适的回收率。确定方法原理：海水样品中的三嗪类除草剂，在碱性条件下用二氯甲烷萃取，萃取3．方法主要参数及实验条件的确定3.1色谱条件的确定色谱条件的选择是方法建立的关键，可优化的条件有色谱柱的类型、柱长、内径、粒径以及流动相的配比和流速等参数。三嗪类除草剂具有较好的亲水性，采用传统C18反相色谱柱即可实现这类化合物的良好分离。本实验通过对比最终确定采用KinetexXBC18色谱柱(4μm，2.1mm×100mm)，以0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）为流动相进行梯度淋洗，梯度洗脱程序见表1，7种目标物及3种内标在10min内可实现良好分离，提取离子色谱图见图2。表1流动相梯度洗脱程序时间（min）A（%）B（%）555555图27种除草剂标准溶液的特征离子质量色谱图3.2质谱条件的确定根据相关文献，本实验采用串联质谱的MRM扫描进行准确定量，用针泵以20μL/min的流速注入1mg/L的三嗪类除草剂的混合标准溶液，电离时会同时产生正负离子，实验表明,正离子[M+H]+采集到的信号较强，因此方法最终确定以正离子方式(ESI+)进行采集。在m/z100~300扫描范围内以正离子模式进行一级质谱图扫描，确定目标物的分子离子。然后分别进行子离子扫描,选取丰度最强且干扰较少的作为各自的定量离子，以次强离子作为定性离子。参照欧盟2002/657/EC决议要求，质谱定性需要4个确证点(Identificationpoint，IP)，三重四级杆质谱的母离子IP为1.0，子离子IP为1.5，因此，本实验选择一个母离子，同时选择两个二级子离子，总确证点即可达到4.0，从而实现质谱的定性确证。最后以多反应监测(M正离子模式优化碰撞能量(Collisionenergy)等质谱参数，使各种化合物在适合的质谱条件下分析，提高目标物的仪器响应，从而提高各化合物的灵敏度。最终确定的离子对信息和碰撞能量见表2。表27种三嗪类除草剂的质谱参数///注：*为定量碎片离子3.3样品前处理方法的确定（1）分别采用固相萃取和液液萃取对海水加标样品进行前处理，HLB固相萃取和二氯甲烷液液萃取测得的三嗪类除草剂回收率均较高。然而，上样500mL海水采用固相萃取方法效率太低，耗费人力或需要辅助海水上样装置；且实际海水样品杂质干扰复杂，500mL上样量超出普通固相萃取柱的负载量。综合以上考虑，最终选择液液萃取方式，对大体积海水样品中除草剂进行处理，对于特丁津等回收率较低现象采用内标法进行校正。图3二氯甲烷和乙酸乙酯液液萃取对三嗪类除草剂回收率的比较（2）本实验在液液萃取过程中，分别比较了二氯甲烷和乙酸乙酯两种有机溶液对目标物的萃取效果（图3），通过比较发现二氯甲烷的整体效果优于乙酸乙酯，因此确定采用二氯甲烷作为萃取溶剂。（3）另外，在最优化条件下，针对不同盐度水体基质样品方法的适用性问题，分别优化了盐度为（0、10、20、30、40%）的水体基质中添加三嗪类除草剂（50ng/L）的回收率影响（图4）。发现盐度为0%的淡水基质中回收率偏高，在110%~150%之间，其中淡水基质中内标含量明显低于其他组，推测内标物质在淡水中的溶解度较大，降低了其在最终定溶液中的浓度，导致回收率偏高。增大水的盐度，可降低内标物质的水溶性，提高萃取量，从而将回收率调整到合适范围。在其他盐度下，7种三嗪类除草剂的回收率差别较小，均在70%~120%之间，说明本方法更适用于一定盐度水体中三嗪类除草剂的测定，后期对于淡水基质考虑前处理中增加盐度来优化其回收率。因此，确定盐度对方法的回收率有一定影响，对于海水基质回收率较好，不需要优化盐图4不同盐度下三嗪类除草剂回收率比较基于以上实验，确定的最优化前处理方法：准确量取500mL过滤后的海水试样，倒入1L分液漏斗中，准确加入50μL混合内标工作液（5.11），振荡混匀，用氨水（5.3）调节pH至9左右；加入40mL二氯甲烷（5.4振荡10min，静置分层，收集萃取液于旋转蒸发瓶中；继续用30mL和20mL二氯甲烷分两次萃取水样，合并萃取液至上述旋转蒸发瓶中，浓缩至约1mL，40℃氮气吹至近干；用0.1%甲酸-乙腈溶液（5.6）1mL溶解残留物，经有机相滤膜（6.7）过滤至进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪测定。3.4定量方法的确定参考标准及文献报道，三嗪类除草剂的定性定量测定主要通过标准溶液外标法。然而，外标法回收率难以保证，准确度不高。本标准引进内标，通过多个内标校正定量，并结合液相色谱-串联质谱分析。外标法和内标校正方法对三嗪类除草剂的回收率比较见图5，发现内标法定量对7种目标组分的回收率普遍高于外标法，因此，确定采用内标法进行定量分析。内标物选择需要与对应目标物的响应相当，同时消除操作过程对分析结果的影响，保证目标物的回收率结果在70%~120%。试验过程中出于成本和操作需要，针对多个目标物在满足回收率条件下，尽量减少内标物的数量。一般对应目标物的氘代物质最适合作为其内标物，而从结构相似性角度，结构中同样具有Cl取代基的西玛津、特丁津和莠去津以莠去津-D5作为内标最为合适，同样具有CH3S取代基的西在优化过程中发现用扑草净-D6和莠去津-D5作为内标校正特丁津时，回收率皆低于50%，不适合作其内标，而选择特丁津-D5做其内标可以将回收率做到70%以上。通过试验筛选，为满足回收率条件确定选择三种内标物（扑草净-D6、莠去津-D5和特丁津-D5）。图5海水中三嗪类除草剂采取不同定量方法的回收率比较3.5标准溶液的稳定性确定本方法采用甲醇溶解，并分别对100μg/mL标准储备液和1.0μg/mL混合标准中间液进行稳定性测试。分别制备两份对照溶液，分别储存于-20℃和-4℃以下避光保存。在不同监测时间点采用当天配置的标准溶液，校对每份对照溶液标准物质含量变化，具体监测结果见下表：表4混合标准溶液稳定性实验数据表5混合内标溶液稳定性实验数据莠去津-D5依据上述数据，为了保证结果的稳定性，确定标准溶液的保质期分别为100μg/mL标准储备液6个月有效期和1.0μg/mL混合标准工作液1个月有效期。3.6样品测定在同样测试条件下，试样液中待测物的保留时间与标准工作液中待测物的保留时间偏差在±2.5%以内，在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的特征离子均应出现，且检测到的离子的相对丰度，应与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表6要求。表6试样相对离子丰度与标准物质相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/（%）允许偏差/（%）>50±20>20～50±25>10～20±30≤10±50试样中三嗪类除草剂的含量按下式计算：V2公式中：X——试样中被测组分三嗪类除草剂的含量，单位为纳克每升（ng/LCi——试样溶液中对应的被测组分浓度，单位为纳克每毫升（ng/mLV1——试样溶液定容体积，单位为毫升（mLV3.7方法检出限、定量限及线性范围的确定用甲醇配置系列浓度的标准溶液，同时含有混合标准外标和内标的溶液，每个溶液中内标浓度相同，外标浓度成梯度浓度分别为1.00μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、内标法准确定量，以目标物定量离子与内标物定量离子峰面积比为纵坐标，质量浓度为横坐标，制作标准曲线,计算回归方程及相关系数(R2)。方法线性范围：1.00ng/mL～100ng/mL，此方法线性范围广，相关系数均大于0.99，线性关系良好，适用于海水中三嗪类除草剂的定量分析。标准曲线在空白海水中添加三嗪类除草剂混合浓度为5ng/L时，峰形明显，信噪比（S/N）均大于3，因此确定方法的检出限为5ng/L。方法定量限是在特定的分析步骤条件下能够准确定量测定的待测物质最小浓度，本方法在添加三嗪类除草剂浓度为10ng/L时，信噪比均大于10，回收率均大于70%，因此最终确定该方法的定量限为10ng/L。图6西草净标准曲线图7西玛津标准曲线图8莠去津标准曲线图9特丁津标准曲线图10莠灭净标准曲线图11扑草净标准曲线图12特丁净标准曲线3.8方法准确度和精密度确定方法验证参照欧盟的实施准则和对农药残留分析的验证程序，在线性范围内通过向空白海水样品中同时添加7种三嗪类除草剂标准溶液，参照确定的处理方法和仪器参数得到回收率和精密度。我们以空白海水为测试对象，添加浓度按照定量限、5倍定量限、10倍定量限，进行加标回收率和精密度实验，以确定方法的准确度和重现性。实验结果见表7，不同浓度的加标量下，样品的回收率都在70%～120%之间，批内和批间的相对标准偏差在15%以下。图13-16显示为空白海水和三个不同浓度加标海水样品的特征离子质量色谱图。从试验结果可以看出，该方法的准确度和精密度可以满足药残检测的要求，且方法操作稳定，重复性好。表7海水中三嗪类除草剂类的添加回收率及精密度量平均回收率%,n=6123123123123123123123123123123123123123123123123123123123123123图13空白海水样品的特征离子质量色谱图图14海水加