3第一章-蛋白质

第一节氨基酸第二节肽第三节蛋白质的结构第四节蛋白质结构与功能的关系第五节蛋白质的理化性质第六节蛋白质的分离纯化第一章蛋白质构件小分子→聚合物→结构→功能→性质第五节蛋白质的理化性质一、蛋白质的两性性质和等电点二、蛋白质的紫外吸收性质三、蛋白质的胶体性质四、蛋白质的沉淀反应五、蛋白质的变性与复性六、蛋白质的呈色反应一、蛋白质的两性性质和等电点1.蛋白质的两性性质在生理条件下，蛋白质表现酸性或碱性，是两性电解质。pH=pI

净电荷=0

pH<pI净电荷为正pH>pI净电荷为负PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+蛋白质的等电点的大小和它所含的酸性AA及碱性AA的数量比例有关：2.蛋白质的等电点

蛋白质溶液的pH在等电点时溶解度最小。

蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260测定范围：0.1～0.5mg/ml二、蛋白质的紫外吸收性质如：－NH3＋、－COO－、－OH、-SH、-CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。三、蛋白质胶体性质

由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围的大小，因而具有胶体溶液的通性。

蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：

１、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。

2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。蛋白质溶液由于具有水化层与电荷两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。蛋白质胶体性质的应用

由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等四.蛋白质的沉淀反应定义：蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。酸酸碱碱碱酸溶液中蛋白质的聚沉（一）可逆沉淀定义：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。1.

盐析

在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。

而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：

破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法

各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不同蛋白质所需中性盐浓度也有不同，只要调节中性盐浓度，就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法称为分段盐析。

我国很早便创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl2）的制豆腐方法，这是成功地应用加热变性沉淀蛋白的一个例子。老豆腐：盐卤作凝固剂（含水量80%—85%）嫩豆腐：石膏或葡萄糖酸内酯作凝固剂制（含水量为85%—90%）实例分析2.等电点沉淀

用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。弱酸或弱碱沉淀法机理：

破坏蛋白质表面净电荷。3.

有机溶剂沉淀法：

在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。有机溶剂沉淀法的机理：

破坏蛋白质的水化膜。注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。（二）不可逆沉淀定义：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、Pb2+

、Cu2+、Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。4.重金属盐沉淀(条件：pH稍大于pI为宜)

当pH稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。

5.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）

生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸等。

生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：

在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。实例分析

在啤酒生产工艺中有麦芽汁加啤酒花煮沸的工序，其目的之一就是借酒花中的单宁类物质怀变性蛋白质或盐形成沉淀，使麦芽汁得以澄清，从而防止成品啤酒产生蛋白质混浊。“柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”6.加热变性沉淀法

加热使蛋白质天然构象解体，疏水基外露，水化层被破坏，从而发生沉淀。

如：煮鸡蛋盐析法：脱去水化层，中和电荷有机溶剂沉淀法：脱去水化层等电点沉淀法：破坏电荷

重金属盐沉淀法：破坏电荷生物碱试剂沉淀法：破坏电荷加热变性沉淀法：破坏水化层蛋白质沉淀法小结不可逆沉淀可逆沉淀天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。变性的实质是次级键被破坏，天然构象解体。变性不涉及共价键的破裂，一级结构保持完好。五、蛋白质的变性与复性1、变性的概念2、引起蛋白质变性的主要因素：A.物理因素：加热、高压、紫外线照射、X-射线、超声波、剧烈振荡和搅拌等B.化学因素：强酸、强碱、脲、去污剂（十二烷基硫酸钠（SDS））、重金属盐、三氯乙酸、浓乙醇等。蛋白质变性后的特征：（1）生物活性丧失；（2）溶解度降低，粘度增加，易絮凝；（3）一些侧链基团暴露，易发生化学反应；（4）变性后蛋白质分子结构松散，易被水解酶作用；（5）组分和分子量没变（一级结构没变）。3、蛋白质变性后的特征蛋白质变性的应用豆腐是大豆蛋白质的浓溶液加热加盐而成的变性蛋白凝固体。急救重金属盐中毒时，可给患者吃大量乳品或蛋清。4.蛋白质的复性定义：当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性。天然构象尿素，

-巯基乙醇变性状态去除变性剂并缓慢氧化

反应试剂颜色反应基团★双缩脲反应

NaOH,稀CuSO4

紫红2个或2个以上肽键★Folin酚试剂反应CuSO4磷钨酸-钼酸兰色酚基★茚三酮反应茚三酮兰紫色游离氨基

Millon反应Millon试剂红色酚基黄色反应HNO3及NH3黄、橘黄苯环乙醛酸反应乙醛酸，H2SO4

紫红色氨酸吲哚基坂口反应次氯酸钠,萘酚,NaOH红色精氨酸的胍基

六、蛋白质的呈色反应★蛋白质定量、定性测定常用方法双缩脲反应含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。红紫色络合物(硷性溶液)Cu2+双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物肽和蛋白质所特有而氨基酸所没有的颜色反应第一节氨基酸第二节肽第三节蛋白质的结构第四节蛋白质结构与功能的关系第五节蛋白质的理化性质第六节蛋白质的分离纯化第一章蛋白质构件小分子→聚合物→结构→功能→性质第六节蛋白质的分离纯化一、蛋白质分离纯化的一般原则二、分离纯化蛋白质的一般程序三、蛋白质含量测定与纯度鉴定四、蛋白质相对分子量的测定一、蛋白质分离纯化的一般原则防止变性和降解低温、条件温和二.蛋白质分离纯化的一般程序1.前处理生物组织破碎、溶解、离心分离

蛋白质提取液2.粗分级盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级分离3.细分级层析、电泳精制品

4.结晶结晶或冻干粉适宜介质2、根据溶解度等电点沉淀盐析（常用硫酸铵）有机溶剂沉淀3、根据电离性质电泳离子交换层析1、根据分子大小透析或超滤离心沉淀凝胶过滤层析4、特异亲和力：亲和层析蛋白质分离纯化的方法

透析和超滤密度梯度离心凝胶过滤层析原理大分子先下来小分子后下来电泳法蛋白质颗粒的大小、形状、所带的电荷不同，在电场中的泳动速度不同离子交换层析亲合层析亲和蛋白配基

蛋白质纯度的鉴定方法：采用物理化学方法如电泳、离心沉降、HPLC和溶解度分析等。采用任何单独的一种方法鉴定纯度只能作为蛋白质均一性的必要条件而非充分条件，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。三、蛋白质含量测定与纯度鉴定

测定蛋白质含量的常用方法：凯氏定氮法双缩脲法（540nm）

Folin-酚试剂法（500nm）紫外吸收法（280nm）染料（考马斯亮蓝）结合法（595nm）比色法灵敏度低灵敏度高2、根据溶解度等电点沉淀盐析（常用硫酸铵）有机溶剂沉淀3、根据电离性质电泳离子交换层析1、根据分子大小透析或超滤离心沉淀凝胶过滤层析4、特异亲和力：亲和层析蛋白质分离纯化的方法四、蛋白质相对分子量的测定

超速离心：蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察旋离过程中蛋白质颗粒的沉降行为凝胶过滤法：测定蛋白质的相对分子量SDS：测定蛋白质的相对分子量毛细管电泳质谱分析

SDSseparatesproteinsbyMWSDS（十二烷基硫酸钠）一种阴离子去污剂，作为变性剂破坏分子内的疏水作用和氢键。目前测定亚基分子量的最好办法。不同的SDS-蛋白质复合体具有相同的荷质比和相同的构象，因此迁移率不受原有的电荷、分子形状的影响，只取决于分子量。且SDS以其烃链与蛋白质分子的