3.细胞培养的基本条件-07资料

细胞培养的基本条件培养细胞生长的条件细胞的营养需要细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

渗透压无污染无毒一、实验室设计及设备器材1.细胞培养室设计原则及要求◆保证无微生物污染和不受其他有毒、有害因素的影响具体工作：器皿洗刷试剂和培养液的配制制备细胞孵育细胞传代细胞的冻存、复苏和运输◆必须树立无菌观念，坚持一贯的无菌操作，进行无菌处理。◆实验室应分为无菌室、准备室和洗刷消毒室，除洗刷消毒室须分隔开外，无菌室和准备室可在同一房间内，但需划分出不同功能区，即无菌操作区和培养、观察区。无菌观念1）无菌室◆为无菌操作而设计的空间，包括操作间和缓冲间。◆操作间又可分为细胞室和感染室◆缓冲间能保护无菌间的无菌环境，可兼有更换无菌衣帽和进行一些简单操作（如放孵育箱、离心等）的功能。◆整个面积约10m2，通入经滤过的无菌空气，与周围实验室比较应保持正压，常备紫外灯，室内其他陈设尽量减少。

无菌室结构模式图back

使用无菌室时应按以下顺序：①熟悉实验计划，背鳍必要的材料和器具，杜绝试验过程中反复出入无菌室。②传戴无菌衣帽和口罩。③关闭杀菌灯，通过一定路线拿如必要物品（应尽量减少出入的次数）。④手部消毒后再进行操作。⑤完成实验后将用完的物品移出室外。⑥擦净实验台，退出后打开灭菌灯。☆每日（使用前）紫外照射（1－2小时），☆每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）☆每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。☆实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。无菌室的维护☆注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。

2）超净工作台（净化工作台）比较密闭，分垂直流和侧流式，外界空气通过滤器从上面、侧面或正面流入操作箱内，并能形成气流屏障，以保持台面无菌。超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

超净台的使用与保养：★平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜★使用前最好开启超净台内紫外灯照射10－30分钟，然后让超净台预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；★使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台无菌工作台操作布局示意图3）无菌箱（1）大型设备工具类

①无菌室、实验室、超净工作台、无菌操作箱等②二氧化碳（CO2）孵箱、恒温孵箱、试管架

2.设备器材CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2

。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。倒置显微镜③倒置显微镜、普通显微镜、实体解剖显微镜及照相系统④高速离心机（水平式500～4000r/min）⑤普通、低温冰箱及液氮装置⑥药品柜、器械柜、实验台等（2）消毒灭菌设备①高压蒸汽灭菌器②干热灭菌器③滤过器（蔡氏滤器、微量超滤膜滤器等）④紫外灯、离子发生器⑤耐酸耐高温容器、吸管自动冲洗器、玻璃器皿清洗箱（3）配液用具①蒸馏水制作系统、阴离子交换树脂装置。②天平称量系统。③pH仪或试纸（精密）④量筒、漏斗、溶量瓶、磁力搅拌器等（4）制备、培养、保存细胞用品①刀、剪、镊等解剖用具，80～200目尼隆网或不锈钢网，血细胞计数板②培养皿、培养瓶、培养管、培养板（4、6、12、24、48、96孔）、离心管③吸管、滴管、吹打管、试管④500ml、250ml、100ml、50ml等溶液瓶⑤涡流混匀器、恒温磁力搅拌器、恒温水浴锅等⑥细胞冻存管等培养板培养瓶酶标仪微孔板震荡器二、实验器材的处理防止微生物污染和细胞污染1.清洗1）玻璃器皿的清洗（1）浸泡★新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，★然后用5％盐酸浸泡过夜；★用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。★注意让水灌满瓶皿，以利充分浸泡、冲洗。★有污染的器皿必须先消毒灭菌后再浸泡、冲洗。（2）刷洗★软毛刷★优质洗涤剂或专用洗涤剂★轻刷，不宜刷洗次数太多（3）浸酸◆器皿干燥后浸酸◆器皿内要充满清洁液，勿留气泡◆注意安全◆浸清洁液处理后的器皿必须彻底冲洗（4）冲洗◆自来水流水冲洗◆蒸馏水冲洗3遍清洁液配制注意事项①选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配置为宜⑤清洁液腐蚀性极强，配置与应用时必须小心，做好防护④清洁液配好后呈棕红色，带边绿色是标明失效③缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将大量产热而发生危险（决不可将重铬酸钾液倒入浓硫酸中）②先将重铬酸钾溶于水中（用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）清洗示意图白箭头：玻璃制品黑箭头：橡胶制品

back2）塑料器皿冲洗流水冲洗晾干后包装，以备灭菌蒸馏水漂洗3次2％～5％盐酸浸泡30min自来水冲洗2％氢氧化钠（NaOH）浸泡过夜晾干自来水冲洗3）胶塞等橡胶类用品的处理自来水冲洗2％氢氧化钠（NaOH）煮沸15min2％～5％盐酸煮沸15min蒸馏水漂洗5次以上晾干后包装自来水冲洗自来水冲洗5次以上蒸馏水煮沸10min烘干备用高压灭菌4）金属器械的清洗新的先用沾有汽油的纱布擦去油脂再用水洗净最后用乙醇棉球擦拭，晾干用过的先以清水煮沸消毒，再擦拭干净使用前以蒸馏水煮沸10分钟，或包装好后101.3kPa高压灭菌15分钟5）除菌滤器的处理2、包装目的：防止消毒灭菌后再次遭受污染包装材料：包装类型：常用的包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸或棉线绳局部包装全包装3、消毒灭菌1.干烤7.抗生素消毒灭菌6.熏蒸消毒5.射线4.紫外线2.高压蒸汽灭菌3.滤过灭菌消毒剂类别名称浓度(%)用途重金属盐红汞2皮肤、粘膜、小创面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化剂高锰酸钾0.1皮肤、尿道、水果、蔬菜消毒过氧化氢3皮肤、粘膜、创伤消毒过氧乙酸0.2～0.5塑料、玻璃、人造纤维消毒卤素类碘液2.5皮肤消毒醇类乙醇70～75皮肤、体温计消毒酚类石炭酸3～5地面、器皿表面和排泄物消毒来苏3～5同上、也常用于手及皮肤消毒表面活性剂新洁尔灭0.1手术器械消毒酸碱类生石灰1:4～1:8排泄物、地面消毒染料龙胆紫2～4表浅创伤消毒8.化学消毒剂三、培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液平衡盐溶液（balancedsaltsolution,BSS）天然培养液合成培养液1.细胞培养对水的要求纯化水蒸馏水（三蒸水）存放时间最好不要超过2周（一）离子交换装置（二）蒸馏水装置2.平衡盐溶液主要成分：无机盐葡萄糖酚红：指示剂常用的BSS种类：（一）Hanks液（三）PBS液（二）Earle液BSS的配制要求：①要防止钙的沉淀②要有良好的缓冲作用主要用途：①作为配制培养液的基础溶液②配制各种试剂③用于洗涤组织和细胞水：新鲜配置的三蒸水或去离子水1.pH7.2PBS贮备液（10×）配法

NaCl8.5g

KCl0.2gNa2HPO4﹒12H2O2.85gKH2PO40.27g

溶于100ml双蒸水中2.PBS使用液配法贮备液50ml

双蒸水450ml细胞培养用液的配制成分RingerPBSEarleHanksDulbeccoD-HanksNaCl(g)8.008.006.808.008.008.00KCl(g)0.420.200.400.400.200.40CaCl(g)0.25

0.200.140.10

MgCL·6H2O(g)

0.10

MgSO4·7H2O(g)

0.200.20

Na2HPO4·H2O(g)

1.56

0.06

0.06NaH2PO4·2H2O(g)

0.14

1.42

KH2PO4(g)

0.20

0.060.200.06NaHPO4(g)

2.200.35

0.35葡萄糖(g)

1.001.00

酚红(g)

0.020.020.020.02几种常用的BSS配方（g/L）3.细胞培养常用试剂1）细胞分离液（消化液）：胰蛋白酶依地酸二钠（disodiumedetate,EDTA-2Na）胶原酶常用的消化液：

◆胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。◆胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。◆胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。（1）胰蛋白酶◆蛋白酶液消化时间：2-10分钟。◆最适作用条件为pH8.0、37℃◆用含血清培养液终止其对细胞的消化作用（2）EDTA(0.01-0.02%)◆一种化学螯合剂，其溶液又称Versene液◆对细胞有一定的解离作用◆毒性小，价格低廉，使用方便（3）胰酶-EDTA◆分散细胞效力好◆浓度分别为0.25和0.02%◆

-20℃保存，不易反复冻融（4）胶原酶(1-5mg/ml)◆从溶组织芽孢梭菌等细菌的培养液中分离得到的一组对胶原蛋白有较强水解作用的酶。◆胶原蛋白富含甘氨酸、羟脯氨酸，普通的蛋白水解酶对其的水解能力弱。◆种类多，不同生化试剂公司的产品种类、纯度、酶活性都有一定差异。◆一般配成10×贮备液，使用前作10倍稀释2）pH调整液◆细胞生长的最适pH为7.0～7.2，可耐受的pH范围是6.6～7.8。◆合成培养液大多呈弱酸◆常用的调正液

NaHCO2；7.4%，5.6％，3.7％

HEPES:10-50mmol/L1NHCL10%HAC1NNaOH◆细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最适用于封闭培养，◆羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。

◆二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。◆大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。3）抗菌素溶液：◆在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。◆常用有青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、两性霉素B等，常联合使用。◆常配成100×或200×浓度，分装，冷冻保存，使用前加入培养液中。抗生素液链霉素(100ug/ml)

青霉素(100单位/ml)

制霉菌素(100单位/ml)

终浓度不超过万分之一为宜抗生素浓度(量/ml）抗菌范围贮存使用真菌细菌支原体青霉素G10000u100u＋＋＋＋＋＋链霉素10000μg100μg＋＋＋庆大霉素10000u

50u＋＋卡那霉素

5000μg

50μg＋＋＋多粘菌素

5000μg

50μg＋＋四环素

1000μg

10μg＋＋＋＋红霉素

5000μg

50μg＋＋两性霉素B

500μg

5μg＋＋＋＋制菌霉素

5000u

25μg＋＋＋＋金霉素10000μg

50μg

＋＋＋＋抗生素用量和抗菌范围4）L-Glutamin溶液◆制备时取L-Glutamin（分子量146.15）6g，溶于三蒸水200ml中，滤过除菌，分装，－20℃冰冻保存◆每100ml培养液中加1mlL-Glutamin溶液4.常用培养基◆培养是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，◆按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；◆按其来源分为合成培养基和天然培养基。天然培养基（naturalmedia)：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限，成分复杂，个体差异大影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染（1）

鸡血浆的制备血浆含有纤维蛋白和一些营养成分，与鸡胚胎汁混合会发生凝固，构成组织细胞生长的环境，有利于细胞向三维空间生长。制备为选择1年左右体大、健壮的雄鸡，禁食1天，从鸡翅取血，混匀离心取上清，分装，－20℃保存①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分（2）血清一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌3.水解乳蛋白（Lactalbumin

hydrolysate,LH）4.鼠尾胶原胶原是细胞生长的良好基质，尤其对组织块和细胞的固定附着、改善生长表面的特性有很好的作用。主要用于组织粘着培养及不易贴壁细胞的附着，并改善生长表面的性质以适合细胞的生长来自大鼠尾腱、豚鼠或牛的真皮、牛眼的晶状体等，大鼠尾胶是最常用的合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成