清洗消毒器 第5部分：清洁效果的性能要求和测试方法 征求意见稿

1GB/T35267.5—XXXX清洗消毒器第5部分清洁效果的性能要求和测试方法本文件规定了对可重复使用医疗器械进行清洗的清洗消毒器及其附件的清洁效果进行测试的程序和试验方法。注2：本文件不适用于可重复使用医疗器械2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO/DIS15883-1:-1，清洗消毒器第1部分：一般要求、术语和定义及试验ISO10993-1医疗器械的生物评价第1部分：风险管理过程中的评价和试验（Biologicalevaluationofmedicaldevices--Part1:Evaluationandtestingwithinariskmanagementprocess）ISO10993-5医疗器械的生物评价第5部分：体外细胞毒性试验（BiologicalEvaluationOfMedicalDevices.Part5:TestsForInVitroCytotoxicity）3术语和定义ISO15883-1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。ISO和IEC在以下地址维护用于标准化的术语数据库：——ISO在线浏览平台：/obp——IEC电百科：/3.13.2行动值需要立即干预的监测值。[来源：ISO11139:2018,3.5]3.33.4预警值特定条件下早期预警的监测值。[来源：ISO11139:2018,3.11－修订版－增加注1]3.53.6分析物用于化学分析的化学物质。[来源：ISO11139:2018,3.1.2]3.73.8清洁2GB/T35267.5—XXXX无可见污染物并且分析物在特定水平以下。[来源：ISO11139:2018,3.45]3.93.10临床应用医疗产品在患者医疗过程的使用。[来源：ISO11139:2018,3.49，修订版－增加注1]3.113.12负载在一个操作周期内要一起处理的产品、设备或材料。[来源：ISO11139:2018,3,155]3.133.14产品过程的结果。[来源：ISO11139:2018,3.217]3.153.16漂洗通过水置换和稀释去除过程残留物。[来源：ISO11139:2018,3.237]3.173.18模拟使用按预期用途模拟医疗器械的使用。3.193.20污染物器械或其表面在使用或模拟使用后的自然或人为污染物。[来源：ISO11139:2018,3.257]3.213.22替代产品在过程模拟中设计用来代表产品，并且与实际产品具有可比性的产品。[来源：ISO11139:2018,3.291]3.233.24试验污染物设计用于替代在使用后的设备上发现的污染物或残留的污染物的配方。[来源：ISO11139:2018,3.300]3.253.26清洗通过水流的方式去除表面的污染物。[来源：ISO11139:2018,3,121]4性能要求4.1概述3GB/T35267.5—XXXX4.1.1除4.1.3-4.1.5规定的要求外，还应符合YY/T0734后续部分对清洗消毒器清洁性能的要求。4.1.2除4.1.4和4.1.5规定的试验外，还应符合YY/T0734后续部分对清洗消毒器清洁试验的要求。4.1.3对确认清洗消毒器符合本标准要求的清洁过程条件，如阶段、温度、压力、流量、化学剂、水质和水量，应按照ISO/DIS15883-1:-，4.1.12和8.2b）进行定义。注1：水质参照ISO/DIS15883-1:-，5.23和GB/4.1.4应在规定的清洁阶段进行清洁效果试验，包括在适当情况下进行冲洗、漂洗等（见5.2）。清洁阶段应按照ISO/DIS15883-1:2020,4.1规定，应证实并记录整个清洁阶段不会干扰分析物的检测。在清洁效果测试中，清洗消毒器应在没有任何消毒或干燥阶段的情况下操作，且不应影响测试过程的有效性和安全性。4.1.5清洁效果试验应在清洗消毒器及其特定负载对应的附件中进行，分为两个阶段：a)在模拟使用条件下，用确定的试验污染物，包括分析物以及典型性负载（见4.4.1）进行的型式试验；b)在临床使用的最具挑战污染负载的条件下进行性能鉴定试验（见4.4.1或若合适（5.4.2使用替代产品进行性能鉴定试验。4.2试验污染物注意事项4.2.1选择试验污染物和涂染方法的理由应得到证明并形成文件。试验污染物配方的选择或开发可以基于文献和临床实践（见附录A及其参考文献）中医疗器械/产品的使用的相关性论证。4.2.2蛋白质试验的污染物应符合B.2规定的性能准则。4.2.3试验污染物的选择，其使用方法和处理（如干燥）应模拟负载最具挑战的临床使用条件。a)试验污染物成分应包括在产品预期使用过程中，可能遇到一定量的代表性污染物的分析物，数量符合4.2.1规定，并且若适用，还应包括产品临床使用中预期被清洁的任何相关材料（s）（如造影剂、润滑油等）；b)试验污染物的使用方法应模拟产品的使用条件，例如，对清洁造成更大挑战的烧灼或加热，和/或可促进材料渗透到产品的各个部分的压力梯度。产品中最难清洁的部件应被污染（见4.3）；c)将试验污染物涂在产品或样品上后，应考虑产品从使用地点到处理地点的运输和停留时间条件（如温度、时间、湿度），以及任何预处理（见）；d)在验证方法中，应对污染物的组成进行表征，并识别和考虑最具挑战的污染物元素（如脂类、黏合剂、不溶性蛋白质等），以确保验证试验可证明对污染物的有效去除。4.2.4试验污染物的提取、回收率方法和分析物检测的方法应得到验证和规定。回收的验证应证明有能力将分析物降低到行动值以下。除非另有说明（见），回收率应大于70%。4.3负载注意事项4.3.1负载类型，包括典型及最具挑战临床使用条件的各类代表性的产品，应加以规定并证明恰当。这些负载应被用于型式试验和性能鉴定试验的清洁效果和过程残留物测试也见ISO/DIS15883-1:-，8.1b）和GB/T35267.4。负载应适合所测试的清洗消毒器类型。注1：在型式试验和性能鉴定试验中，若适用，当证明替代品可以作为前述产品的代表去用于某些试验时，负载就4GB/T35267.5—XXXX4.3.2应考虑产品类型和患者接触区域的任何适用物理特征，包括但不限于：——铰链和连接处；——粗糙不规则表面；——材料组成，包括孔隙；——接头和盲端；——内部可移动部分（例如，线缆）。这些设计特点具有更大的污染物聚集和滞留风险，在整个产品的清洁效果和清洁终点的评估和风险评估中应特别加以考虑。注1：其他的医疗器械设计及清洁的细节见4.3.3任何在其说明书中规定的必要的预处理，例如，人工预清洁或拆卸，应在试验程序中体现。4.4清结效果试验方法4.4.1概述清洁效果应通过目视检查（见4.4.2）和蛋白质定量检测（见，注释和附件B）来确定。对于侵入性医疗器械，在型式试验中，至少应使用另外一种有效的定量分析测试方法来测量除蛋白质外的其他分析物。非侵入性医疗器械只需要目视检查。注1：一些非侵入性医疗器械可能代表较高的风险水平，例如婴儿配方奶粉4.4.2目视检查在清洁阶段结束后，目视检查应证明所有可观察到的负载表面都没有可见的污染物。本要求不适用于由于产品的结构而无法对产品表面进行目视检查的情况。充分的目视检查包括：——明确地检查说明；——充足的照明；——检查辅助设备，如适用（如发光放大镜——观察距离。更多目视检查的信息参见EN13018和ASTME3106。4.4.3分析方法概述分析物的接受标准是根据报警限值和行动值规定的。蛋白质和其他分析物的报警限值和行动值已在和中规定。它们的行动值是测试期间可接受的清洁效果的最大标准，但目标值是作为报警限值给出的。当报警限值和行动值都规定时，如果检测到的分析行动值在两个水平之间，则应进行调查，但应认为可以通过清洁要求。5GB/T35267.5—XXXX为了符合ISO/DIS15883-1:2020第4.2和6.10条的要求，应使用行动值。注1：本文档中分析物值以单位面积（cm）表示。一些区域和国家指南规定了每个医疗器械或每个医疗器械侧面的最大分析行动值。不可能直接将每平方厘米表示的数值与每个医疗器械或每个医疗器械侧面表示的数值进行比较，除非已知医疗器械或医疗器械侧面的表面积蛋白质测定标准蛋白质测定标准为：——报警限值≥3μg/cm2；——行动值≥6.4μg/cm2。对于每个样本，清洁后的产品上蛋白质最大的可接受水平应比行动值低。（见参考注1：蛋白质检测方法可包括附录C中规定的方法其他分析物的实验方法若使用其他分析物，清洁后的产品上，这些分析物的可接受水平，包括：a)总有机碳（TOC）1)报警限值≥6μg/cm2（见参考【85】）2)行动值≥12μg/cm2（见参考【67】）注1：TOC是指有机物中含碳总量，以非可b)碳水化合物1)报警限值≥0.9μg/cm22)行动值≥1.8μg/cm2（见参考【34】，【40】和【53】）注2：Dubois等人[53]的检测单糖的方法有所不同，因此碳水化合物因组成不同，测试水平也是有所不同。报警限c)血红蛋白1)报警限值≥1.0μg/cm2（见参考【73】）2)行动值≥2.2μg/cm2（见参考【34】、【35】、【42】和【51】）注3：血红蛋白检测方法可包括附件D中规定的方法d)三磷酸腺苷（ATP）1)报警限值≥10fmol，ATP/cm2（见参考【37】和【89】）2)行动值≥22fmol，ATP/cm2（见参考【36】、【37】和【43】）注4：相对光单位（RLU）到飞摩尔的转换可以从特定的ATP监1)报警限值≥2.2EU/器械（参见【12】和【33】）2)行动值≥20EU/器械（参见【12】【32】和【33】）注6：对于直接或间接接触心血管系统和淋巴系统的植入物和产品，推荐内毒4.4.4过程残留清洗阶段，包括任何清洗后的漂洗，不得在负载上留下任何可能在后续使用中有害或损害后续过程阶段的过程残留物（见5.5）。6GB/T35267.5—XXXX5试验方法5.1清洁试验方法验证5.1.1概述型式试验（见5.3）和性能鉴定试验（见5.4）所采用的清洁试验方法应进行验证。注1：清洁试验方法包括试验污染物、污染方法、回5.1.2负载污染方法负载污染方法，包括其应用和任何处理，应模拟清洗消毒器清洁阶段的等效挑战，就像最具挑战的临床污染负载所呈现的一样，包括指定的负载载体（见4.2.3和5.2.1）。负载污染方法应规定所有条件，包括对污染产品进行一定时间、温度和湿度（即停留时间）的干燥，这将代表在清洗消毒器中待处理的产品的使用条件。注1：条件制定示例参见Köhnlein等人25.1.3检测方法对于用于清洁验证研究的每种分析物和每种方法，应确定直接或提取的检测限值。应确定试验污染物的回收率。应计算出相应的校正因子并应用于结果（见4.2.4）。注1：ISO11737-1[2]给出了确定生物负载量回收率的方法和应用生物负载量校正因子的例子。这些原则和一般应进行阳性和阴性对照，以识别过程条件对检测方法的干扰（见5.2.2）。5.1.4分析物测定方法应对用于清洁验证研究的每种分析物的选择方法进行验证。5.2清洗消毒器要求5.2.1清洁试验应在规定的清洗消毒器负载上进行。最具挑战的负载应包括代表性的产品和指定的负载架。除非另有说明，载有代表性产品的每种负载架都应单独进行测试。5.2.2应规定清洗消毒器清洗阶段的参数和清洗过程中的化学剂。型式试验应在规定的最具挑战参数（如温度、时间、过程化学剂浓度、供给、压力和流速）下进行。5.2.3清洁验证应在没有任何消毒或干燥阶段的情况下进行测试（见ISO/DIS15883-1:-，6.10）。5.3清洁模式试验基本原则除本文件要求外，ISO15883其他适用部分的相关清洁试验要求也应适用。5.3.2试剂/材料7GB/T35267.5—XXXX应使用凝血或符合4.2标准的试验污染物。5.3.3程序试验负载、清洗消毒器腔壁和负载架应使用试验污染物进行污染（见4.2.1和4.3）。污染表面应按中所述进行处理。清洁试验阶段应在清洗消毒器定义的最具挑战处理条件下进行，重复三次（见5.2.2）。5.3.4可接受准则清洁效果应符合4.4.2规定的无可见污染物，并符合4.4.3规定的试验负载的行动值。若适用，清洁效果应符合4.4.3规定的试验负载的报警限值。对于腔壁和负载架来说，目视检查可满足要求。5.4清洁性能鉴定试验5.4.1基本原则测试应符合ISO/DIS15883-1:-，6.10.3和ISO15883的适用部分。5.4.2试剂/材料清洗消毒器应使用经临床污染的实际负载进行测试。这些负载应该是清洗消毒器要处理的具有代表性的负载，包括已知的难以清洁的产品。对于特定的产品，可以使用模拟临床使用条件的替代产品来进行清洁效果验证。替代产品和试验污染物应判断（见5.1和4.2）是否适用于临床使用条件。注1：替代产品可以用来模拟在不破坏情况下难以取样或取样方法提取效5.4.3程序污染物表面在清洁之前应保持在最具挑战的代表性停留条件（如时间、温度和湿度）下（见）。清洁试验应在可类比负载上进行，重复三次（见5.2）。5.4.4可接受准则清洁效果应符合4.4.2规定的无可见污染物，并符合4.4.3规定的试验负载的行动值。若适用，清洁效果应符合4.4.3试验负载的报警限值。对于腔壁和负载架，目测检查即可（见4.4.2）。5.5过程残留5.5.1概述作为型式测试的一部分，在风险分析和细胞毒性测试要求中应规定可接受的过程残留量。性能鉴定试验要求对产品进行过程残留的定期取样（见ISO/DIS15883-1:—，表A.1）。如果过程或过程化学剂发生变化，应重复进行型式试验和性能鉴定试验。所有准备在清洗消毒器中使用的过程化学剂都应符合这一要求。8GB/T35267.5—XXXX5.5.2风险分析风险分析应形成文件，证明过程残留风险已降低到有害水平以下。风险分析应考虑ISO10993-1的要求。5.5.3细胞毒性包括清洗消毒器及其负载在内的医疗器械应进行细胞毒性测试，以证明其不存在潜在的有害残留物，除非根据风险评估另有证明（见ISO/DIS15883-1:-，4.4和4.6）。任何此类风险评估都应包括验证过程中使用的过程化学剂的细胞毒性。参见[45]和[47]。根据ISO10993-1定义的风险分析，可能需要额外的生物相容性测试。5.5.4取样方法应规定从负载中提取过程残留物的取样方法和检测样品中过程残留物的分析方法。这些方法应能够确定过程化学剂低于规定的潜在有害浓度（即可接受最大浓度见ISO/DIS15883-1:-，6.10.4）。5.5.5可接受准则应基于风险分析或细胞毒性试验结果规定行动值和报警限值。9GB/T35267.5—XXXX附录B（资料性）附录C试验污染物示例C.1概述表A.1提供了可用于测试清洁效果的试验污染物的简化示例，以满足4.2的要求。没有单一的试验污染物可被确定为用于所有临床实践的代表。表A.1试验污染物制备方法的示例——0.1ML肝素（10IU）/100mL羊血。4℃~8℃GB/T35267.5—XXXX将组分A和B溶解在相应的溶剂A和B中，室温（20~物——牛白蛋白：0.5g——（可选）牛胆汁：20g——碳酸氢钠：2gGB/T35267.5—XXXX每100mL羊血注入0.1mL肝素。4℃~8℃保存备GB/T35267.5—XXXX注1：使用国家法规允许的含有特定动物来源注2：表A.1中提供的试验污染物及其制备方法的详细资料可以在-2209,。ATCC编号是该参考培养标本提供的GB/T35267.5—XXXX附录E（规范性）附录F基于蛋白质污染物的性能评价F.1原则F.1.1试验背景该测试方法基于本文件的实验室内试验方案获得的测试结果。该测试方案主要研究了在规定的温度和暴露时间条件下，规定测试污染物的溶解情况。在模拟不锈钢平面的标准化测试件（STP）上涂上新鲜凝结的羊血作为测试污染物。将涂抹测试污染物的STP浸入化学成分确定的清洗剂配方中，以评估清洁效果。通过确定的提取蛋白质的测定方法测定清洁度。F.1.2试验方案本附录规定了使用已定义的试验方法评估蛋白质污染物的试验方案。应根据临床相关性（见4.2）选择用于符合附录B的试验污染物，并且还应满足B.2中规定的验收标准。所选择的试验污染物应含有最低量的蛋白质，而与其他任何成分无关，以符合本附录的评估和一致注1：测试污染物中初始蛋白质不足不利于协议执行的预期顺序如下：a)溶液和试剂的制备；b)通过清洗，涂污染物，调节，切割和称重来制备STPs；c)控制溶液的紫外可见光谱（UV-Vis）邻苯二甲醛（OPA）法；d)牛血清白蛋白（BSA）标准溶液的制备和校准曲线的建立；e)用于阴性对照STPs的UV-VisOPA方法；f)用于阳性对照STPs的UV-VisOPA方法；g)通过浸泡、萃取、洗脱和UV-VisOPA分析对处理过的STPs进行测试；h)最后清洁所有已处理的STPs。F.2验收标准当按照本附录的要求进行测试时，所选的测试污染物（见4.2.2）应符合表B.1规定的标准。蛋白质的剩余百分比使用公式（B.3）计算，见B.11.3。表B.1经测试的STPs的验收标准被测试的STPs上残留的污染物剩余蛋白质应为12%且≥2%GB/T35267.5—XXXX被测试的STPs上残留的污染物F.3STP准备F.3.1概述B.3.1.1和B.3.1.2中规定了STP的材料和尺寸以及试验所需的STPs数量。F.3.1.1所需STPs数量测试总共需要12个STPs。这包括：a)8个带涂层的STPs-在纯水中进行两个测试，两个温度和两个时间点，每个测试条件重复两次；b)2个带涂层的STPs-阳性对照测试；c)2个无涂层的STPs-阴性对照测试。F.3.1.2材料和尺寸STPs由厚度为0.127mm的退火316L不锈钢箔制成。最终尺寸为50mm×50mm。F.3.2不锈钢箔制备不锈钢箔条应切割成长（220~250）mm×宽200mm，用5号迈耶棒（见表B.2）清洁并涂上试验污染物，然后干燥。然后将不锈钢箔从箔的中心切成50mm×50mm的STPs（每边留有25mm的余量/用于处理用于试验，然后进行处理。STPs只能使用一次，并且测试系列所需的所有STPs应同时准备。F.3.2.1不锈钢箔表面处理F.在用测试污染物涂覆之前，应清洗长（220~250）mm×宽200mm的不锈钢箔，并确认不含蛋白质。F.为便于不锈钢箔的背面识别，清洗前需要使用划线器将不锈钢箔背面划线分割为50mmx50mm的标准测试方格（STPs）并编号，如图B.1所示。图B.1不锈钢箔裁至大约250mm×200mm，刻在一面划线识别F.3.2.2不锈钢箔的清洗过程GB/T35267.5—XXXX划线的不锈钢箔和所有直接相关的设备应按以下方法清洗。表B.2所示为过程所需设备、表B.3所示为过程所需化学品。具有相似参数的设备和化学品可以代替表B.2和表B.3中所列的设备或药品，但是所用的不锈钢应与表B.2中规定的相同。表B.2设备———Faithfull工具，StockNDartford,KentDA26QE,长度（230~270）mm— Litlington,Royston,Hwww.rubbersuckers.co.http://suctioncupsu用于实验室间研究的设备可以来自所列供应商；也可以使用其他供应商。表B.3清洗不锈钢箔和相关设备所需的化学品———用于实验室间研究的化学品来自所列供应商；可以使用其他供应商。F.3.2.3步骤按照如下步骤将不锈钢箔与设备分开清洗：a)将需要清洗的不锈钢箔或设备放入适当大小的清洁塑料容器内；b)在大烧杯中准备足量的质量比为5%的Decon90清洗液；c)将溶液加热至45℃至50℃,加热过程一直搅拌；d)将加热的溶液加入塑料容器中，确保所有设备完全浸入；GB/T35267.5—XXXXe)静置10min，偶尔摇晃容器；f)倒出清洗剂溶液；g)用纯水冲洗设备两次，同时保持摇摆运动，以确保所有的清洗剂都从设备上清除；h)用异丙醇冲洗设备，以便于干燥；i)小心地将清洗过的设备取出并放置在适当的无蛋白质环境中。F.3.3STPs涂层F.3.3.1注意事项应采取预防措施，以确保将规定量的测试污染物仅施加到不锈钢箔未划刻侧的指定区域上，不能覆盖划定的一侧，并确保测试污染物不会溢出箔的边缘。注意有关涂层STPs的视频指南可从以下链接获得：https:www.youtube.com/watch？v=V6-1v0aM-P0https:www.youtube.com/watch？v=Y-iDF1pKJJAF.3.3.2步骤如下对不锈钢箔进行涂层：a)确保使用新鲜制作的测试污染物；b)将有划痕的不锈钢箔的面朝下放在无蛋白的防滑表面上；c)在不锈钢箔的一面（无划痕的一侧）均匀地涂抹约5mL的测试污染物（见图B.2），不要超出边缘；d)用5号迈耶棒（K涂层机）压力均匀平稳地摊开测试污染物；e)在20℃至25℃（室温）下，使涂层的不锈钢箔干燥至少2至4个小时；f)用干净的剪刀小心地将涂层的不锈钢箔切成单独的STPs（如B.所述，约50mmx50mm），沿划线（反面）切割，同时避免污染涂层侧；g)在受控条件下，将各个STPs置于20℃至25℃和40％至60％相对湿度（RH）的条件下并存储24小时±2小时（请参阅B.3.5）；h)检查STPs，并放弃所有未完全覆盖的STPs；i)用精度是4位数实验分析天平上称重所有STPs，并记录重量[见表E.4（阳性对照）和表E.5（浸没STPs）]；注2：可以使用干净的不含蛋白质的塑料一次性培养皿或类似物来称量和储存STPs，确保测试污染物涂层面一直朝上，以防止STPs背面被蛋白质污染，并且在使j)在受控条件下，24小时内使用涂层并称重的STPs，并确保不使用时将其保持在上述条件下；k)确保STPs在运输过程中和使用前保持覆盖。图B.2迈耶棒方向显示的涂有涂层的一面朝上GB/T35267.5—XXXXF.3.4阴性对照STPsF.3.4.1步骤如下准备阴性对照STPs：a)将一块不锈钢箔划成两个50x50mmSTPs，并标识为N1和N2。切成单独的STPs并清洁（请参阅B.3.2.3）；b)在实验室分析天平上称量各个STPs的重量，并记录重量（见表E.3）。注意可以使用干净的无蛋白的塑料一次性培养皿或类似物称重并存储切好的STPs，以防止STPs的蛋F.3.5STPs保存F.3.5.1概述对STPs的进行保存的条件：温度在20℃至25℃之间，相对湿度（RH）在40％至60％之间进行。保存的设备和试剂应至少准备2小时，然后再用测试污染物对不锈钢箔进行涂层。F.3.5.2步骤保存STPs的条件如下：a)使用适当尺寸的干燥器或密闭室，在适当尺寸的容器中边搅拌边向100mL的纯水中添加足够的硝酸镁[Mg(NO3)2]，以得到饱和溶液，确保未溶解的硝酸镁残留在容器中；b)将饱和溶液转移到更大的容器（例如大培养皿）中，并将其放在干燥器/腔室的底部；c)固定干燥器/腔室并关闭，确保其气密；d)保持至少2小时的相对湿度稳定；e)在受控条件下，将各个STPs置于20℃至25℃和40％至60％相对湿度（RH）的条件下并保存24h±2h。F.4浸渍试验装置F.4.1概述进行浸渍测试所需的设备和附件在下面列出，并在图B.3中以图形方式表示。F.4.2装置a)有固定速度设置（50rpm）的磁力搅拌炉；b)长度25mm，直径6mm的磁力搅拌棒；c)纯水；d)玻璃烧杯（400mL深蹲型，直径80mm）；e)玻璃烧杯温度测量系统[(0-100)℃±0.5℃]；f)铁支架、蒸馏瓶夹及固定PVC吸帽的装置，并将夹具和STPs固定在适当位置，避免与涂覆区域直接接触；g)秒表；h)长镊子；i)PVC吸帽。GB/T35267.5—XXXX1—温度探头或温度计；2—蒸馏瓶夹（和长镊子一起固定3—铁支架；4—长镊子；5—PVC吸帽；6—玻璃烧杯；7—STPs（标准测试件8—纯水（平衡）；9—磁子；10—磁力搅拌炉。图B.3浸渍试验装置F.5浸渍试验过程F.5.1概述浸渍测试过程在两个温度，25℃±2℃和75℃±2℃,两个时间间隔30s和90s下进行。F.5.2步骤进行浸渍试验如下：a)将100mL纯水放入400mL烧杯中。调整搅拌速度到50rpm；b)确保烧杯中的温度处于所需的测试温度，并在±2℃的公差范围内；c)将受污染的STPs一面朝下放置在适当清洁、无蛋白质的表面上，将40mm的PVC吸帽附着在未涂覆的一面上，并将长钳固定在PVC吸帽上（见图B.4）；d)将STPs以水平方向悬浮在烧杯中的纯水中（见图B.3深度足够完全浸没（大约10mm到15mm），但也不要接触磁力搅拌棒，并启动秒表。有必要在浸入STPs之前暂时关闭搅拌器，以防止在STPs被污染的一面表面形成气泡；GB/T35267.5—XXXXe)在规定的浸泡时间后，停止搅拌，取下夹紧的STPs，轻轻剥离测试溶液；f)将STPs固定在PVC吸力帽上，用长钳固定，将STPs的一侧放在无蛋白吸水性纸巾上30s（见）；g)置于含有洗脱液和b.6.2中配制的玻璃微珠的500mL玻璃烧杯上。使用无蛋白镊子拉上吸帽边缘的吸脱扣片，让STPs落入洗脱液中（见图B.6）；h)每次浸泡温度和浸泡时间重复浸泡测试两次。图B.4将长钳和吸帽安装到STPs上图B.5STPs浸泡30s后放置图B.6将STPs放置在洗脱溶液中，并拆卸吸帽GB/T35267.5—XXXXF.6STPs洗脱过程F.6.1概述将洗脱过程中残留的蛋白质提取到洗脱溶液中，然后用OPA试剂使用紫外-可见光谱法对其进行分析。应戴无蛋白质非乳胶手套，以避免蛋白质污染。F.6.2步骤洗脱STPs中残留蛋白如下：a)将10mL洗脱溶液（1%SDS溶液见B.12.2）倒入500mL烧杯中；b)向烧杯中加入2.0g（200~400）μm的玻璃珠；c)将STPs放入洗脱溶液后（见B.5.2g），盖上烧杯以减少蒸发；d)在20℃至25℃的轨道振动筛上搅拌（20~30）min；注1：搅拌时间是为了让所有残留蛋白有足够的时间从STPs中洗脱出来，其他测试污染物可e)停止搅动，使用无蛋白镊子去除STPs，确保玻璃珠保留在烧杯中，把STPs放在蛋白质不吸收组织上，保留STPs，通过重量分析确定STPs的涂层重量（见B.10）；f)让洗脱的溶液静置，直到玻璃珠沉淀到烧杯底部。小心地将洗脱液倒入小瓶（如闪烁小瓶盖上盖子，确保玻璃珠保留在烧杯中。在瓶子上贴上STPs编号和测试条件，例如STPs#1,25℃,30秒，重复1；g)用UV-VisOPA方法分析洗脱溶液（见B.9）。F.7UV-Vis邻苯二甲醛（OPA）法F.7.1概述用OPA法萃取后，直接用紫外－可见分光光度法定量测定洗脱液中的残留蛋白质含量。应使用该方法获得UV-Vis吸光度读数。这一过程需要校准曲线和UV-VIS标准/控制。F.7.2设备执行UV-Vis分析需要以下设备和附件：a)紫外-可见分光光度计，波长340nm；b)可校准的移液枪；c)一次性吸液管；d)相同类型和品牌的比色皿；或用于300nm以上分析的高质量一次性比色皿，由耐刮擦材料制成，消光系数变化最小；e)适当的实验室玻璃器具（例如烧杯、容量瓶等）。F.7.3校准曲线对于复杂蛋白质样品的定量，测试污染物中的蛋白质浓度应参照牛血清白蛋白V（BSA）进行评估。这使得可以通过使用BSA校准曲线来定量STPs上的蛋白质。注1：所获得的量化值仅表示以牛血清白蛋白当量F.7.4牛血清白蛋白原液制备GB/T35267.5—XXXXF.7.4.1概述牛血清白蛋白（BSA）校准曲线用于测定STPs上的蛋白质含量。表B.4列出了所需的材料，用于制备校准曲线的稀释样品。表B.4BSA原液所需化学用品--F.7.4.2步骤按如下方式准备BSA原液：a)称出100mg±0.1mg固体牛血清白蛋白，记录重量，加入100mL容量瓶中；b)在装有固体牛血清白蛋白的容量瓶中加入1%SDS溶液，轻轻搅拌，标定至100mL，确保完全溶解，原液浓度为1.0mg/mL(1000µg/mL)；注1：该原液用于进行所有后续稀释，以构建BSA校准曲线，并c)使用校准移液枪从BSA原液中制备稀释液，使用1%SDS溶液作为稀释剂以便覆盖2.5µg/mL至800µg/mL的初始浓度范围（参见表E.2）；注2：浓度不应超过800µl/mL(+20µl/mL)，d)不使用时，稀释液应保持在20℃至25℃（室温），远离光线，F.7.5OPA法的UV-Vis系统和试剂兼容性F.7.5.1概述在分析之前，有必要确定试剂和稀释剂是否适合使用，以最大限度地减少错误结果。应使用四（4）种因素来确定设备（分光光度计和比色皿）是否合格，并使用两（2）种试剂来确定测试期间获得的吸光度是否可靠。这可确保：a)使用的稀释剂是可接受的（即未降解）；b)测量的吸光度被归一化以用于计算，并考虑了用于制备样品的试剂和稀释剂的吸光度。F.7.5.2系统适宜性控制F.应在使用UV-VIS分光光度计进行分析之前和之后执行四（4）个系统适宜性控制。表B.5中列出了控制方法和典型吸收值。表B.5系统适宜性测试在仪器中没有比色皿的情况下，从UV-Vis分光光度计（在如果获得的值不在-0.001和+0.001之间，则只需在仪器上-在进行样品计算时，当用于后续分析时，试管的任何吸光-典型吸收：-0.001至0.001（或自动调零时为0.000）GB/T35267.5—XXXX-只用1%的SDS溶液装满试管，并从溶液中获得三个读数。-典型吸光度：0.03至0.05-仅将SDS/硼酸盐溶液装入试管，并从溶液中获得三个读-典型吸光度：0.03至0.05-只用OPA试剂装满试管，从溶液中获得三个读数。-典型吸收：0.09至0.11，应为≤0.15F.对于每个对照组，在构建BSA校准曲线（见B.7.6）和平均值（见表E.1）之前，获得三（3）个值。对于系统适用性和试剂控制（B.7.5.3），使用相同的比色皿被认为是标准做法。但是，在不可行的情况下，应采取措施避免比色皿内不一致和比色皿之间的差异。F.在每次分光光度分析之前，应将比色皿用1％SDS溶液冲洗两次。F.7.5.3试剂对照F.在使用UV-Vis分光光度计进行分析之前和之后，应进行两次试剂的对照。表B.6列出了控制方法和典型吸收值。表B.6试剂控制试验/硼酸盐溶液（1：1v/v比例）填充比色皿。使用一次性—用已校准的自动移液器向试管中加入等体积的1％SDS溶F.对于两个对照，在构建BSA校准曲线之前（参见B.7.6）获得三（3）个值并记录平均值（参见表E.1）F.在每次分光光度分析之前，应将比色皿用1％SDS溶液冲洗两次。如果在同一过程中试剂对照A溶液的吸光度大于试剂对照B的吸光度，则应重新制备溶液。F.7.6绘制BSA校准曲线以下步骤用于标称体积为3.0mL的比色皿。如果比色皿的标称体积大于或小于此值，请相应地调整体积。使用等体积的样品和稀释剂（1：1体积比的混合物）。如果使用的所有比色皿对所用试剂的吸光度相近，则可以使用多个比色皿确定样品的吸光度。F.7.6.1样品制备和紫外数据采集步骤准备样品以获取数据，如下所示：a)确保在进行前的同一天已执行系统适用性控制（请参阅B.7.5.2）和试剂控制（请参阅B.7.5.3GB/T35267.5—XXXXb)使用已校准的自动移液器，将等体积的对照试剂A和准备好的待测BSA稀释液（例如1.50mL的对照试剂A和+1.50mLBSA稀释液）添加到比色皿中；c)用一次性移液器混合比色皿中的内容物。应注意尽量减少气泡的形成，因为这会干扰分光光度计的读数；d)静置60s至90s，并确保样品不浑浊；e)将比色皿放在UV-Vis分光光度计中，并从溶液中获得三个读数。记录平均值（见表E.2注2：所获得的吸光度是针对BSA样品/在使用的稀释f)移开比色皿，丢弃内容物并用1％SDS溶液冲洗两次；g)使用校准的自动移液器向试管中加入等体积的OPA试剂和准备好的待测BSA稀释液（例如1.50mLOPA试剂和+1.50mLBSA稀释液）；h)用一次性移液器混合比色皿中的内容物，应注意尽量减少气泡的形成，因为这会干扰分光光度计的读数；i)静置60s至90s，并确保样品不浑浊；j)将比色皿放在UV-Vis分光光度计中，并从溶液中获得三个读数，记录平均值（见表E.2注3：所获得的吸光度是使用稀释浓度的BSA样品/Ok)移开比色皿，丢弃内容物，并用1％SDS溶液冲洗两次；l)对准备覆盖2.5µg/mL至800µg/mL范围的所有BSA稀释液重复B.7.6.1b）至B.7.6.1注4：用比色皿中的稀释剂将BSA溶液样品的浓度（BSA初始浓度）有效地减半（称F.7.6.2校正标准化平均样品吸光度（NEBSA）计算每个BSA稀释样品的平均吸光度，然后使用试剂对照进行减法归一化（见表E.2）。a)标准化BSA样品/自身吸光度（SAEn）是平均吸光度值－平均试剂对照A；b)标准化BSA样品/OPA试剂（OPAEn）是平均吸光度值－平均试剂对照B；c)校正标准化平均样品吸光度（NEN）为OPAEn-SAEn。式中，“n”是被测样品的BSA初始浓度，单位为µg/mL。F.7.6.3绘制BSA标准曲线绘制BSA标准曲线方法如下：a)将标准化BSA浓度(µg/mL,x轴)与校正标准化样本平均吸光度(NEBSA,y轴)进行绘图，并用线性趋势拟合的方法(y=mx+c类型)拟合成一条最佳拟合线。b)确定并记录（见表E.1）曲线图斜率（x-系数项）、曲线图截距（c-截距项）和r²值（R2要求＞0.990）。曲线图的代数式项用于计算阴性、阳性和浸泡试验STPs样品中污染物的蛋白质浓度。F.8阴性和阳性对照F.8.1阴性对照STPs无涂层的STPs作空白测定，用来确定干扰物质的背景水平。在检测前，确保作为阴性对照的两种STPs（N1,N2）的重量都已确定并记录。应在构建BSA校准曲线后进行阴性对照STPs蛋白测定。使用洗脱法完成STPs提取，然后使用OPA方法获得校正标准化平均样本吸光度（NE），然后从BSA标准曲线推导出代数式的项，确定两个单独STPs上的蛋白质（作为BSA当量）的数量。GB/T35267.5—XXXX注意检测极限是试剂对照A的吸光度（见B.7.5.3）。F.8.1.1测量阴性对照STPs上蛋白质的含量测量阴性对照STPs蛋白质含量的方法如下：a)通过洗脱法完成STP的提取（见B.6）。对保留的STP进行重量分析（见B.10）。b)确保系统适宜性控制（见b.7.5.2）和试剂控制（见b.7.5.3）在进行前的同一天执行。c)用一个标有刻度的自动移液管将等体积的试剂对照品a和提取的阴性对照STP洗脱溶液（各1.50mL）加入比色皿中。d)用一次性吸管混合比色皿内的物质。应尽量减少气泡的形成，气泡会干扰分光光度计读数的准确性。e)静置(60~90)s，确保样品不浑浊/模糊。f)将样品放入紫外－可见分光光度计中，得到溶液的三次读数。记录平均值（见表E.3）。g)取出比色皿，弃去内容物，用1%SDS溶液冲洗两次。h)使用标有刻度的自动吸管将等体积的OPA试剂和提取的阴性对照STP洗脱溶液（各1.50mL）加入比色皿中。i)用一次性吸管混合比色皿内的物质。应尽量减少气泡的形成，气泡会干扰分光光度计读数的准确性。j)静置(60~90)s，并确保样品不浑浊/模糊。k)将比色皿放入紫外－可见分光光度计中，从溶液中获得三次读数。记录平均值（见表E.3）。l)取出比色皿，弃去内容物，用1%SDS溶液冲洗两次。m)重复B.8.1.1a）到B.8.1.1l)，建立另一个阴性对照STP。F.8.1.2校正标准化阴性对照样品的吸光度（NEn）F.计算每个阴性对照样品各自吸光度的平均值，然后使用试剂对照进行减法的归一化（见表a)标准化样品/自吸光度(SAEn）=平均吸光度值-平均试剂对照A；b)标准化样品/OPA试剂(OPAEn）=平均吸光度值-平均试剂对照B；c)阴性对照的校正标准化样本平均吸光度STPs:NEn=OPAEn-SAEn。其中，对于STP为N1或N2，n的值是1或2。F.每个阴性对照STP试验的蛋白质含量（mg）使用下面的公式（B.1）计算，其中项x（系数）和c（截距）之前已通过BSA校准曲线确定：xNxNE−c然后计算阴性对照STPs的平均蛋白含量（见表E.3）。F.8.2阳性对照STPsGB/T35267.5—XXXX确保在试验前确定并记录两种作为阳性对照的STPs的重量[见B.3.3.2i)]。阳性对照STPs蛋白试验应在BSA标准曲线建立后进行。使用洗脱法完成STP提取，然后使用OPA方法获得校正标准化平均样本吸光度（NE然后使用从BSA校准曲线推导出代数式的项，确定两个单独STPs上的蛋白质（作为BSA当量）的数量。应计算两个阳性对照STPs的平均蛋白质含量，然后结合STPs涂层平均重量（见B.10）来确定每一污染物上的蛋白质含量（mg蛋白质/mg污染物涂层）。该值用于计算在浸泡试验中所使用的涂层STPs上蛋白质的理论涂层量。检测的极限为试剂对照A获得的吸光度（见B.7.5.3）。F.8.2.1检测阳性对照STPs的蛋白含量检测阳性对照STPs蛋白含量如下：a)通过洗脱法完成STP提取（见B.6）。对保留的STP进行重量分析（见B.10）。除了已规定的STP编号外，还要将洗脱内容标记为P1和P2。b)在进行对照之前，准备好适合的材料（见B.7.5.2）和试剂用量（见B.7.5.3）。c)使用校准的自动移液管将1000μl阳性对照STP洗脱溶液添加到含有4mL（4000μl）1%SDS溶液的小瓶中，并充分混合。这是必要的稀释步骤，以确保获得的吸光度值在BSA校准曲线的线性范围内。d)用经校准的自动移液管，向试管中加入等量的试剂对照组A和1号稀释样品（见B.8.2.1c）各50mL。e)使用一次性移液管混合试管中的试剂。应注意尽量减少气泡的形成，因为这会干扰分光光度计的读数。f)放置60秒至90秒，确保样品不混浊/模糊。g)将样品放置于紫外可见分光光度计中，并读取溶液的三个读数。记录其平均值（见表E.4）。h)倒掉试管中的溶液，并用1%SDS溶液冲洗两次试管。i)使用经校准的自动移液管，向试管中加入等量的OPA试剂和1号稀释样品（见B.8.2.1c）各50mL。j)使用一次性移液管混合试管中的试剂。应注意尽量减少气泡的形成，因为这会干扰分光光度计的读数。k)放置60秒至90秒，确保样品不混浊/模糊。l)将试管放置于紫外可见分光光度计中，并读取溶液的三个读数。记录其平均值（见表E.4）m)倒掉试管中的溶液，并用1%SDS溶液冲洗两次试管。n)重复B8.2.1a）至B8.2.1m）步骤，来获得另一个阳性对照STP。F.8.2.2校正标准化阳性对照样品吸光度值（NEn）F.对于所使用的每个阳性对照样品，计算各自的平均吸光度值，然后使用试剂对照品通过减法进行归一化，如下：a)标准化样品/自身吸光度值（SAEn）是记录的阳性对照试剂A组的平均吸光度值；b)标准化样品/OPA试剂（OPAEn）是记录的阳性对照试剂B组的平均吸光度值；c)阳性对照STPs的校正标准化平均样品吸光度值NEn）=（OPAEn）-（SAEn其中，n为1或2时是相对于STPs的P1或P2，如B.8.2.1a）中所述。GB/T35267.5—XXXXF.每个被检测样品的蛋白质含量（mg）由以下公式（B.2）得出，其中公式中的x（系数）和c（截距）已由BSA校准曲线确定：xNxNE−c然后计算出所有检测的阳性对照组STPs的平均蛋白质含量。F.9浸泡试验STPs残留蛋白质的测定-紫外可见光谱分析法对于经过浸泡试验（见B.5）洗脱萃取（见B.6）的STPs，如果样品吸光度大于1.200，则在进行紫外可见光谱分析之前，洗脱溶液可能需要额外稀释[见B.9b]。用紫外可见分光光度法测定残余蛋白质，如下所示。a)按照阴性对照STPs的蛋白质含量测定方法（见B.8.1.1并利用公式（B.1见B.）计算残余蛋白质含量；b)如果发现吸光度值大于1.200，则按照包括额外稀释步骤的阳性对照STPs蛋白质含量测量方法（见B8.2.1），并使用公式（B2）计算残余蛋白质含量（见B.）；c)记录结果（见表E.5）。F.10STP涂层重量的测定F.10.1清洁使用过的STPs应彻底清洁、干燥和称重试验使用的所有STPs，以确定STP的实际污染物涂层重量。F.10.2步骤测定STP涂层重量如下：a)向干净的玻璃烧杯（500mL）中加入300mLSDS清洗液（见B.12.3），并加热至40℃;b)将STPs上所有松散的玻璃珠去除；c)将所有STPs放入清洗液中；d)连续搅拌溶液（10～15）min，确保STPs不会粘连在一起；e)使用镊子取出单个的STP，浸入含有500mL纯水的烧杯中，同时旋转STPs，然后浸入含有500mL纯水的第二个干净烧杯中，再次旋转；f)用镊子将STP浸入含有100mL丙酮或70%异丙醇的烧杯中，并旋转溶液；g)用镊子取出STP，放在无绒布或纸巾上，让两边风干；h)检查STP的清洁度（使用镊子操作STP）。如果有可见微粒/残留物，重复B.10.2的步骤；i)对其余所有的STPs重复B.10.2e）至B.10.2h）的操作步骤。F.10.3STPs涂层重量（重量分析）进行重量分析如下：a)使用干净并且干燥的镊子或钳子，用精确到小数点后4位的实验室分析天平分别称量已彻底清洁和干燥（见B.10.2）的所有处理后的STPs，并记录重量（见表E.3、E.4和E.5）；b)从B.3.3.2i阳性对照和浸泡STPs）或B.3.4.1B阴性对照）中确定的STPs总重量减去清洁的STP重量[见B.10.3a）]来计算STP涂层重量。见表E.3、E.4和E.5。F.11浸泡后STPs上蛋白质残留量的计算GB/T35267.5—XXXXF.11.1使用以下计算方法计算每片的蛋白质含量，并记录结果（详见表格E.4）。阳性对照蛋白平均含量（详见B.）÷平均阳性对照毛重（详见B.10.3）。F.11.2使用以下方式计算并记录结果，计算用于浸泡试验的STP的理论计算蛋白质含量（mg详见表STPn重量（见B.10.3）x每片的蛋白质含量（见B.11.1）。其中“n”是选定的STP编号。F.11.3使用公式（B.3）计算测试STP上剩余的蛋白质百分比，如下所示 理论计算蛋白质含量详见B.11.2)F.11.4根据公式（B.3）计算的剩余蛋白质百分比应符合B.2中规定的验收标准。F.12溶液的制备F.12.1概述下面制备的溶液，尤其是含有十二烷基硫酸钠（SDS）作为组分的溶液，偶尔会变得浑浊，通常在20℃以下或长期储存时。使用前，应检查所有溶液是否有沉淀。如果观察到沉淀，在温水下将溶液加热至35℃并搅拌，直到所有固体溶解。制备的溶液，尤其是用于进行紫外光可见光控制的溶液（详见B.7.5）应清澈无可见杂质。F.12.2含量1%SDS溶液的制备1%SDS（十二烷基硫酸钠）溶液（见表B.7）应用作已处理STPs浸泡的洗脱溶液，以及用于UV-Vis分析的稀释剂和比色皿冲洗溶液。该溶液也用作UV-Vis对照品（系统适用性试验）。以下方法适用于2.0通常足以进行试验。溶液在20℃至25℃（室温）下稳定，无需特殊储存。表B.71%十二烷基硫酸钠溶液所需的成分--制备1%十二烷基硫酸钠溶液如下：a)称取20.000g±0.002g十二烷基硫酸钠并记录重量；b)在2L烧杯中加入1800mL纯水；c)向纯水中加入十二烷基硫酸钠，搅拌直至得到溶液；d)如果需要，使用氢氧化钠溶液测量并调节pH至11.0–11.1；e)将溶液转移到2L容量瓶中；f)用150mL纯水冲洗2L烧杯，并向容量瓶中添加洗涤液；g)用更多的纯水补充至容量瓶上的2L标记；h)塞住容量瓶并混合内容物；i)将2L容量瓶中的物质转移到合适的瓶子中；j)在瓶子上贴上准备日期和内容物的标签。F.12.3处理后的STPs清洗液的制备GB/T35267.5—XXXX在测定涂层重量（见B.10）之前，用10%w/w十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（见表B.8）清洗处理过的STPs。以下方法适用于2.0L，通常足以进行清洁。溶液在20℃至25℃（室温）下稳定，无需特殊储存。表B.810%（w/w）十二烷基硫酸钠溶液所需的成分--制备STP清洗液如下：a)称取200.0g±0.5g十二烷基硫酸钠并记录重量；b)向2L烧杯中添加1800g±0.5g纯水（按重量计）；c)向纯水中加入十二烷基硫酸钠，搅拌直至得到溶液。如果需要帮助溶解，加热至50℃;d)转移到一个合适的瓶子里，贴上内容物和制备日期的标签；e)溶液在20℃至25℃（室温）下稳定，无需特殊储存。F.12.4含量20%（w/w）十二烷基硫酸钠溶液的制备使用20%（w/w）SDS（十二烷基硫酸钠）溶液（见表B.9）作为成分制备SDS/硼酸盐（见B.12.6）和OPA试剂（见B.12.7）。以下方法适用于200mL。溶液在20℃至25℃（室温）下稳定，无需特殊储存。表B.920%（w/w）十二烷基硫酸钠溶液所需的成分 按如下方法制备20%（无重量）SDS溶液：a)将140mL的纯水加入一个200mL的容量瓶中；b)称量40.00g±0.02gSDS，并记录重量；c)将SDS部分加入体积瓶，同时轻轻搅拌以帮助溶解（如需要可加热至50℃);d)溶解后，加入纯水，达到200mL；e)停止使用容量瓶，轻轻混合内容物，以减少发泡；f)将容量瓶中的内容物转移到合适的瓶子和标签内容物中。制备20%（w/w）SDS溶液使溶液搅拌泡沫。混合应保持在最低限度，但足以帮助固体溶解。F.12.50.1M硼酸盐溶液的制备0.1M硼酸盐溶液（见表B.10）用作制备SDS/硼酸盐（见B.12.6）和OPA试剂（见B.12.7）.该溶液在20℃至25℃（室温）下保持稳定，不需要特殊存储。表B.100.1M硼酸盐溶液所需的组分--按如下方法制备0.1M的硼酸盐溶液：a)称量76.20g±0.01g十水合四硼酸钠，并记录重量；b)将1500mL的纯水（已加热至40℃至45℃)加入一个2L的烧杯中；c)将十水合四硼酸钠加入含有纯水的烧杯中，搅拌至溶解；d)将溶液转移到一个2L的容量瓶中；GB/T35267.5—XXXXe)用3x100mL纯水冲洗出2L烧杯，并在2L容量烧瓶中加入洗涤液；f)允许2L容量瓶中的内容物平衡到20℃至25℃（室温）；g)用纯水、塞子和混合物配制到2L标记；h)将0.1M硼酸盐溶液转移到瓶子中，并标明内容物和准备日期。F.12.6SDS/硼酸盐溶液的制备SDS/硼酸盐溶液（见表B.11）作为稀释剂，以确定测试样品的自吸光度，并构建BSA校准曲线（见B.7.6）该溶液也用作紫外－可见控制（系统适用性测试）。以下方法为1.0l，溶液在20℃至25℃（室温）下稳定，不需要特殊存储。表B.11SDS/硼酸盐溶液成分组成---->99.0%-->99.0% 配置SDS/硼酸盐溶液，方法如下：a)将以下溶液依次加入1L容量瓶中，倒入时轻轻搅拌；1)20%(w/w)SDS溶液50mL，3)纯水20mL；b)向1L容量瓶中缓缓加入0.1M硼酸盐溶液，直至瓶内溶液体积达到1L；c)塞住容量瓶并使瓶内各溶剂充分混合，然后将溶液转移到合适的瓶子中，并贴上溶剂名称和制备日期的标签；d)使用1M氢氧化钠溶液将溶液的pH值调节至9.3±0.1。F.12.7OPA试剂的制备以OPA试剂（见表B.12）为稀释剂，测定供试品和为构建BSA校准曲线而制备的稀释样品的OPA吸光度。试剂也是紫外－可见对照品（系统适用性试验）。以下方法适用于1.0L。将OPA试剂储存在20℃至25℃（室温）的暗处，直至需要使用，并在14天内使用。表B.12OPA试剂所需成分>99.0%>98.0%-- >99.0%>99.0%->99.0% 制备OPA试剂溶液，方法如下：a)称取1.6g±0.01gOPA和4.64g±0.005g2-巯基乙磺酸钠分别放在小瓶中并记录重量；b)向OPA中添加20mL甲醇并溶解固体，视情况在纯水下短暂加热，以帮助溶解；c)向2-巯基乙磺酸钠中加入20mL纯水，溶解固体；GB/T35267.5—XXXXd)在1L烧杯中，添加50mL20%（w/w）SDS溶液和750mL0.1M硼酸盐溶液，并轻轻搅拌混合；e)向烧杯中加入OPA/甲醇溶液[见B.12.7B）]，并用20mL0.1M硼酸盐溶液冲洗小瓶。向烧杯中加入冲洗液；f)向烧杯中加入2-巯基乙磺酸钠盐溶液[见B.12.7c）]，并用20mL0.1M硼酸盐溶液冲洗小瓶。向烧杯中加入冲洗液；g)盖上烧杯并继续搅拌，直到所有固体溶解并获得完整的溶液；h)将烧杯中的液体倒入1L容量瓶中；i)每次使用50mL0.1M硼酸盐溶液冲洗烧杯两次，并向烧瓶中添加冲洗液；j)用0.1M硼酸盐溶液补充至1L标记；塞住并混合溶液；k)将溶液转移到适当大小的瓶子中（首选黄褐色玻璃）；l)使用1M氢氧化钠溶液将溶液的pH值调节至9.3±0.1；m)用铝箔包裹容量瓶底部和颈部，以避免溶液降解。GB/T35267.5—XXXX附录H（资料性）附录I检测和评估残留蛋白质污染物试验方法的示例型式检验（以及性能和常规检测）中清洁效果的初步检查采用目视检查法。残留蛋白质的定量分析应只适用于目测清洁的产品。定量检测方法的选择应考虑其检测范围、准确性和特异性，且应与验收标准和被检产品相适应。改良的邻苯二甲醛（OPA）法（见参考文献[57]、[74]和[75]）和二喹啉甲酸（BCA）方法（见参考文献[90]和[92]）是取样后蛋白质定量的首选方法。由于OPA和BCA方法不直接测定蛋白质，残留的过程化学品或其他物质可能会干扰蛋白质的测定。因此，需要检测阴性对照（即与检测器械相同处理和提取的未受污染的医疗器械）以排除干扰。I.1.1样品处理通过用1%十二烷基硫酸钠（SDS）的水溶液冲洗（或提取）产品或产品的指定区域，来获得残留蛋白质分析样品。应优先提取产品中与患者组织接触并在重复使用过程中产生转移风险的区域。这样可避免结果来自产品非关键区域。应将用于提取的1%SDS溶液应将pH值调节到11，并使用刻度至少为0.5pH单位的pH试纸，或用0.1N的氢氧化钠溶液校准过的pH计进行测定。蛋白质提取方法的有效性应通过确保所有残留物都溶解来检验，例如，通过使用蛋白染色剂对非溶性残留物进行染色，如考马斯亮蓝R-250、氨基黑、SYPRORuby、STAINSALL（广谱染色剂）、PonceauS（丽春红S）。注1：所描述的光谱检测方法不能有效地检测到提取物应用最小体积的1%SDS溶液进行提取，以避免因使用大体积提取而引起的任何分析误差，并有一个适当的检测限来评估检测样品表面蛋白质残留的实际情况。大体积提取会因稀释效应而显著降低总灵敏度。因此，提取体积应尽可能小的同时确保所有被污染的表面能不断被浸湿或浸没，允许提取液在取样表面上流动。然而，过少体积提取会降低蛋白质回收率。因此，需要仔细地平衡漂洗体积。浸湿产品比将提取体积降低到给定限度以下更重要。此外，小体积重复提取比大体积单次提取更有效。若染色显示有不溶解的蛋白质，可以通过加热SDS溶液（如，40℃)和超声的方式来提高提取效率。注2：在参考文献[94]公布的数据表明，在温度高的pH=11SDS溶液可以用于溶解来自血样中高分子量纤维蛋白残留不能使用光谱检测方法来测定任何没有经过过滤或单独的浊度测量校正的混浊溶液中的蛋白质。如果浑浊是由于后处理中的错误造成的，则应确定产生浑浊的原因并加以纠正。浑浊样本可使用0.2µm注射过滤器过滤除去混浊，但必须确保滤膜不吸附蛋白质。膜过滤应与蛋白质测定的所有其他步骤一起进行验证。使用SDS溶液的提取应在一段确定的时间内进行，期间应进行密集搅拌（无论是手工搅拌还是使用涡旋器）或冲洗。例如，SDS提取可以通过浸泡30分钟，每10分钟进行30秒的密集搅拌/冲洗来完成。也GB/T35267.5—XXXX可以使用其他验证过的提取方法。提取方法应确保获得适当的提取效率值。例1：用2-5mLSDS溶液的聚苯烯袋提取产品表面的蛋白质。可以使用装有2-5mL1%SDS溶液的密封、牢固且大到可容纳产品的聚苯烯（pp）袋来提取整个产品上的残留污染物。一旦产品密封在有1%SDS溶液的袋中，就可通过翻转或摇动袋和通过袋操作产品来提取。铰链产品应通过袋子操作，以使SDS溶液与铰链的隐藏表面接触。注3：聚丙烯、其他袋材料和塑料管通常用助滑剂或脱模剂（例如脲酰胺）进行处理，从而使在产品密集混合过程中从塑料表面释放出来，并在提取液中产生浑浊。这是测试阴性对照的很好做法（即与测试产品相同处理和提取的未污染产品），以识别任何干扰。带有腔体或者大且容易接近空腔的产品（如穿刺套管）的提取用一个合适的聚丙烯塑料袋也是可行的。通过来回倾斜，SDS溶液可以定向例2：用2-3mLSDS溶液从铰链产品中部分提取蛋白质一些铰链产品（如：Crile夹具）被用于标准化测试，以评估关键功能区域的清洁效果，如铰链。在SDS溶液中萃取时，铰链需要对接点进行密集活动。例3：用2-5mLSDS溶液从轴管中提取提取具有狭长腔体的产品时，可以将其末端放置在烧杯中并用实验室支架夹子固定直立。使用移液管或注射器将2-5mL的SDS溶液注入冲洗产品管腔中。从烧杯中抽取SDS溶液。在提取过程中，每间隔一段时间（如5min），使用同一SDS溶液来回冲洗循环5次。类似的提取过程也可以用于可拆卸的微创外科（MIS）产品，通过将轴与具有功能端的插入件分离，并将插入件放置在长度和内径都足以容纳产品的一段试管中。夹紧或密封一端，加入SDS溶液进行提取。同样夹紧或密封另一端并旋转产品，使SDS溶液来回流动。内部通道可能接触到污染物质且无法目测的样品，应用SDS溶液冲洗以收集样品。I.1.2蛋白质检测方法的校准残留蛋白的准确定量取决于用于该方法制备的标准蛋白。用于校准的标准蛋白为牛血清白蛋白（BSA，分数V）。准备或购买浓度为200mg/mL的BSA标准原液。使用1%SDS溶液中稀释此原液制备浓度梯度的稀释液（例如200µg/mL，100µg/mL，50µg/mL，25µg/mL，12.5µg/mL，6.25µg/mL），并储存在干净的试管中。产品提取物的蛋白质含量通过比较提取物的测量值与通过已知浓度的标准溶液标准曲线的回归线计算得出的标准曲线来决定。标准样品和提取物样品应以相同的方式进行分析。I.2评价残留蛋白污染物的改良OPA法改良的邻苯二甲醛（OPA）法是一种测定一级氨基团的定量方法，它们存在于蛋白质多肽链的游离α-氨基和赖氨酸(ε-）上。OPA法在N，N-二甲基-2-巯基乙基氯化铵和一级氨基团的存在下，形成稳定的荧光色烷基硫-2-烷基异吲哚，在340nm处可用分光光度法检测。伯胺普遍存在自然界中，且可出现在加工过程中使用的化学物质中，因此要将阴性对照的确定包括在内，以排除可能干扰的物质。注可以使用类似或更高精度的方法，例如：荧光计（见参考文献[82]）。制备OPA试剂溶液时，应将40mg邻苯二甲醛溶于1mL甲醇中（混合至完全溶解），然后加入50mL的0.1M四硼酸二钠缓冲液（pH为9.3）100mg的N，N-二甲基-2-巯基乙基氯化铵和1.25mL的20%SDS水溶液。应将溶液储存在不透明的瓶子中以避免光线照射，且配制当天使用有效。GB/T35267.5—XXXX用1%SDS溶液以相同比例稀释OPA试剂来制备分光度计空白组，用于标准溶液和产品提取物的蛋白质测定。使用空白试验值将分光光度计调零。调整分光光度计波长为340nm，并使用光程1cm的石英比色皿（或适用于此波长的一次性半微量比色皿）。在测量标准溶液和产品提取物样品时，使用相同比例的样品和OPA试剂。例如，加入200µl标准溶液或提取样品到1mL（1：5）新制备的OPA溶液中。只要反应混合物的pH保持在9.3（用pH试纸确认），样品与OPA试剂的比例可降到1：1。较低的稀释浓度会导致OPA试剂的pH发生变化，并有可能使结果无效。使用吸液管混合反应液，或使用瓶盖盖住比色皿，并轻轻摇晃对溶液进行完全混合。反应5min并将混合后产生的所有气泡除去后，测定其吸光度值。当吸光度值＞0.010时，所分析的样品可能含有可吸收340nm波长光的物质。因此，应确定自吸光度值并从OPA测量结果中减去。自吸光度的测定采用相同比例的样品加入1%SDS溶液中（代替OPA试剂）。吸取200µl的1%SDS产物提取液到1mL的1%SDS溶液中，混合并测定1%SDS溶液的吸光度。从OPA反应后样品的吸光度和相对于牛血清白蛋白稀释系列的校准确定的蛋白质量中减去（见C.1.2）。I.2.3蛋白质含量的计算为了计算产品或提取部分上的总残留蛋白，应考虑提取中所使用的SDS溶液的体积。提取样品中蛋白质的浓度(µg/mL）乘以用于提取被测产品/区域的1%SDS的总体积（mL）。例如，如果测定的蛋白质浓度为10µg/mL，提取液体积为5mL，则总残留蛋白质为50µg。如上述，不必要的高提取液体积会导致蛋白质计算结果倍增、分析干扰及干扰蛋白质测定方法。I.2.4验收标准/结果解释查阅有关干扰物质的相关文献。I.3评价残留蛋白质污染物的BCA方法二喹啉甲酸法与双缩脲反应相似，在碱性环境中，蛋白质将Cu2+还原成Cu+，Cu+与2分子的二喹啉甲酸结合生成在562nm波长处有最大吸收的紫色生色团。在试验环境下，可将Cu2+还原成Cu+的其他物质也会形成BCA生色团。因此，进行阴性对照组有助于排除干扰。I.3.2材料/试剂试剂A和B的配制如下：试剂A：将1g的2,2-联喹啉-4,4－二甲酸二钠，2g的碳酸钠，0.16g的酒石酸钠，0.4g的NaOH和0.95g的碳酸氢钠加入100mL蒸馏水中，并用10M的氢氧化钠溶液调节pH至11.25。试剂B：将0.4g五水硫酸铜加入10mL蒸馏水中。将100份试剂A与2份试剂B混合制备成标准溶液（SWS）。将SWS溶液储存在不透光的瓶子中以避免光线照射，且配制当天使用有效。将100µl提取液或标准溶液加入1mLSWS（或200µl提取物或标准溶液和2mLSWS）作为试验，将100µl纯水加1mLSWS作为空白对照组。混合并在室温下反应两小时（20℃±1℃)。然后在10分钟内用分GB/T35267.5—XXXX光光度计在562nm波长下测量空白对照、标准BSA溶液和产品提取样品，通过在清洁的试管中测量纯化水来重置为零，通过从测量值中减去空白值来调整测量值。注意：BCA试验的显色依据反应速率（没有真正反应终点反应颜色随着反应物（Cu2+和过量BCA）的消耗变深。生色团在10min内无明显偏差。产品提取物的蛋白质浓度是通过与牛血清白蛋白标准比较进行确定（见C.1.2）。产品提取物的蛋白浓度相对于牛血清白蛋白标准。I.3.4总蛋白含量的计算计算产品提取物的总蛋白（见C.2.3）。I.3.5验收标准/结果解释查阅有关干扰物质的相关文献。GB/T35267.5—XXXX附录K（资料性）附录L检测血红蛋白以评估清洁效果的测试方法示例L.1血红蛋白检测方法L.1.1原理除了通过目视检查对清洁效果进行初步检查外，还可在残留蛋白测试的基础上，进行残留血红蛋白测试。残留血红蛋白的检测可以根据污垢的种类的调整。方法的选择应考虑其检测范围、准确性和特异性，并应适合验收标准和待测试的产品。血红蛋白化学定量中，所有的反应都发生在非蛋白血红素成分中，其中心位置的铁分子是氧结合的位置。由于下面描述的定量方法不能直接测量血红蛋白（或直接在特定波长测量残留的工艺化学品或其他物质可能会干扰血红蛋白反应或可能在相同的波长吸收。而测试阴性对照（即与测试产品相同加工和提取的未污染样品）有助于排除化学或光学干扰。L.1.2样品用于残留血红蛋白分析的样品是通过用1%十二烷基硫酸钠（SDS），pH为11的水溶液对产品或产品的目标区域进行冲洗（洗脱）或擦拭得到的。关于残留蛋白提取方法的详细信息，请参照本文档的C.1.1部分，这些方法同样适用于血红蛋白。L.2微血尿测试条对血红蛋白的半定量分析L.2.1原理市售的检测试纸非常灵敏，是快速获得半定量残留血红蛋白评估结果的简便方法，可作为初步筛查试验。这些产品不需要特殊设备，在几分钟内给出检测结果，检出限（LOD）<1µg/mL。这些检测试纸使用了一种基于血红蛋白假过氧化物酶活性的化学物质。因为LOD与允许的残留血红蛋白限值相比非常低，因此对于确认清洗后的手术器械上是否残留血红蛋白十分有用。例如，如果测试产品的表面积为100cm2，干预水平为2ug/cm2，则允许的残留血红蛋白为220μg。L.2.2程序a)将一滴产品提取液（见D.1.2）滴在测试区域（检测试纸的末端），然后擦拭（从测试条的侧边）或轻敲试纸，去除多