GB∕ T 40251-2021 牡蛎单孢子虫病诊断规程 原位杂交法（正式版）

ICS65.020.30牡蛎单孢子虫病诊断规程原位杂交法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40251—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。1GB/T40251—2021牡蛎单孢子虫病诊断规程原位杂交法本文件规定了牡蛎单孢子虫病诊断规程中病原定位方法的要求，针对主要病原尼氏单孢子虫本文件适用于尼氏单孢子虫在牡蛎中感染程度的评估和确诊；其他贝类也可参照执行。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SC/T7205.1—2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。AP:碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)BCIP:5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-甲苯胺盐(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatep-toluidinesalt)DAFA:戴维森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液(davidson'salcohol-formalin-aceticacidfixative)DIG:地高辛(digoxigenin)EDTA-Na₂·2H₂O:二水合乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediaminetetraaceticacid,disodiumdi-hydrate)MgCl₂·6H₂O:六水合氯化镁(magnesiumchloridehexahydrate)NaCl:氯化钠(sodiumchloride)Na₂HPO₄·12H₂O:十二水合磷酸氢二钠(sodiumphosphatedibasicdodecahydrate)Na₃C₆H₅O,·2H₂O:二水合柠檬酸三钠(sodiumcitratedihydrate)NBT:氯化硝基四氮唑蓝(4-Nitrobluetetrazoliumchloride)KH₂PO₄:磷酸二氢钾(potassiumphosphatemonobasic)KCl:氯化钾(potassiumchloride)PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersalinebuffer)SSC:枸橼酸钠缓冲液(salinesodiumcitratebuffer)Tris:三羟甲基氨基甲烷(Tris[hydroxymethyl]aminomethane)25试剂或材料5.5Na₂HPO₄·12H₂O。5.9MgCl₂·6H₂O。5.12BCIP。5.13蛋白酶K。5.14多聚赖氨酸(相对分子质量25000)。5.15聚乙烯醇(相对分子质量30000～70000)。5.17俾斯麦棕Y。5.19聚蔗糖400。5.20聚乙烯吡咯烷酮360。5.24石蜡(熔点52℃~54℃):切片级。5.26丹哈特液(Denhardt's)。5.27鲑精DNA。5.31浓盐酸。5.33二甲苯。5.35无水乙醇。5.3695%乙醇。5.37甲醛(37%)。3GB/T40251—20215.49100pg/mL蛋白酶K:按A.15.570.5%俾斯麦棕Y(BismarkbrownY):按A.24配制。6.7烘片机。度高于15%时为采样的最佳时期。稚贝(附着后～2mm)和幼贝(2mm～30mm)取内脏团；成贝(>30mm)取胃、肠道、闭壳肌和外套膜。4GB/T40251—20218试验步骤组织块依次浸入盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中；流程如下：70%乙醇(1h45min)→80%乙醇(1h45min)→80%乙醇(1h45min)→95%乙醇(45min)→95%乙醇(脱水后的组织块依次浸入盛有无水乙醇：二甲苯(1:1)混合液和二甲苯溶液的烧杯中，流程如下：8.2原位杂交(每次3min)。8.2.2切片平放在切片保湿孵育箱中，吸取500μL100pg/mL蛋白酶K溶液，加到每张组织切片上，8.2.3把组织切片上的蛋白酶K溶液吸净，然后将其浸入预冷到4℃的0.4%甲醛溶液中5min。8.2.5把组织切片平放在切片保湿孵育箱中，添加500μL杂交缓冲液至每张组织切片，42℃孵育8.2.6添加500μL含2ng/μLDIG标记的寡聚核苷酸探针杂交混合液至每张组织切片，置于90℃~95℃平板烘片机上保温10min。8.2.7将组织切片置于平整的冰面上淬冷1min。5缓冲液I(1min～2min,室温)。8.2.11用缓冲液Ⅱ将AP-抗DIG稀释至0.75U/μ9结果判定9.1检测结果成立条件6(规范性)试剂配方A.1DAFA固定液95%乙醇甲醛(37%)冰醋酸过滤海水A.280%乙醇95%乙醇加水定容至A.370%乙醇95%乙醇加水定容至95%乙醇加水定容至A.5500μg/mL多聚赖氨酸多聚赖氨酸(相对分子质量25000)加水定容至A.620×SSCNaClNa₃C₆H₅O₇·2H₂O加水溶解定容至调节pH至A.72×SSC20×SSC水330mL220mL335mL950mL700mL950mL500mL950mL900mL7水水A.10PBSNaClNa₂HPO₄·12H₂O蛋白酶K10mg/mL蛋白酶K甲醛(37%)水A.14杂交缓冲液100%甲酰胺25%硫酸葡聚糖NaCl用浓HCl调节pH至8加水定容至A.16缓冲液I10×缓冲液I水A.17缓冲液Ⅱ山羊血清缓冲液I2mL在60℃~80℃水浴中溶解，不断晃动，直至颗粒溶解。4℃可贮存2周。A.1810×缓冲液ⅢNaCI58.4g加水溶解至800mL用浓HCl调节pH至9.5MgCl₂·6H₂O101.6g加水定容至1000mLA.19缓冲液ⅢEDTA-Na₂·2H₂OA.21缓冲液IV10×缓冲液IV水A.2210%聚乙烯醇聚乙烯醇(相对分子质量30000～70000)加水溶解至900mL9A.23显色液缓冲液ⅢmL盐酸左旋咪唑10%聚乙烯醇mL4℃保存用前在每1mL上述混合液中加入：NBTA.240.5%俾斯麦棕Y俾斯麦棕Yg水mL把染料溶于水中，过滤。室温贮存。A.25NBT贮存液二甲基甲酰胺0.931mL避光，—20℃贮存。A.26BCIP贮存液二甲基甲酰胺2mLA.2720×丹哈特液牛血清白蛋白0.4g聚蔗糖4000.4g聚乙烯吡咯烷酮3600.4g加水溶解并定容至100mL0.45μm的滤器过滤，5mL/支分装，—20℃贮存。A.2825%硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖25g加水定容至100mL低热搅拌片刻使之溶解，—20℃保存。A.2910mg/mL鲑精DNA将鲑精DNA钠盐加入水中，用玻璃棒搅拌直至