ELISA检测技术课件

ELISA检测技术

ELISA技术

酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay，ELISA)，是利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白分离，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。ELISA技术的三个基本原理抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性；抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性和酶活性；酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。ELISA的分类、原理和操作竞争法 原理：通过a组和b组显色的差异，来确定标本中待测蛋白的量加酶标记抗原加底物显色

优点：

1、待测抗原只需一个免疫结合位点，适合小分子抗原如激素和药物之类；

2、操作步骤简单快捷，只需一个保温洗涤过程。

缺点：

1、酶标记抗体的用量大；

2、定量检测的灵敏度和重复性存在不足。双抗夹心法双抗夹心法改良双抗夹心法

优点：

1、待测抗原需要两个或两个以上的免疫结合位点，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量5000D以上；

2、由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良的双抗加心法；

3、重复性提高。

缺点：

1、操作复杂，费时费力。抑制性测定间接法测抗原

此方法操作简单、迅捷但重复性一般较差；通常用于抗体效价的测定和某些疾病的早期诊断。ELISA的操作要点样品的保存试剂的准备加样固相载体包被洗涤封闭保温显色和比色样本提取与保存

1）在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需-80℃冰存。

2）取约0.3-0.4g转基因水稻样品，加500-1000μlPBS缓冲液，用研钵磨碎，将研磨液转入Eppendorf管中，10000rpm，4℃离心10min，取上清备用。

最佳取样时间为水稻分蘖期，取样时不同植株应取自同一部位的样品；该样品依所携外源基因不同其存放时间不同；如BT水稻样品可存放于-20℃三个月，-80℃半年以上。在提取样品的过程中，装入样品研磨液的Bf管应置于冰浴中；上清应置于4℃，最多只能存放4天

试剂的准备

ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的；自配的缓冲液应用pH计测量较正；从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用；最好现配现用。ELISA的固相载体

最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能。国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。在实验前，必须经紫外射线照射1~2小时后，其对免疫球蛋白的吸附性能增加

已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2-8℃）干燥的条件下一般可保存6个月。包被的方式

定义：将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被，抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果包被的最适当浓度随载体和包被物的性质及酶结合物的浓度协调选定。

加样

在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般定量多道加液器，使加液过程迅速完成。封闭

1）定义：是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。

2）目的：抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。

3）常用试剂：实验室用的封闭剂是2%的牛血清白蛋白。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的而在洗涤时可清除在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质洗涤时可清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质洗涤方式（浸泡式）a.

甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置3分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.甩去液体后在吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3次。保温

1）在ELISA中抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育。

2）温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。

3）保温时为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。显色和比色显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色时间一般不需要严格控制及时判断。比色使用酶标比色仪在405nm波长读数。若要终止反应，以防反应过度，常用的碱性磷酸酶反应终止液为1MNaOH,每孔100ul。标准曲线建立样品10μl+990μlPBSBradford法测定样品中可溶性蛋白浓度100μl混合液+1000μlG-250紫外分光光度计、595nm依标准曲线测定测定值*100＝样品总蛋白浓度用牛血清白蛋白（BSA）建立。分别配制5、10、15、20、30、50、80、100、140（μg•ml-1）的标准蛋白溶液（用PBS配制）系列。ELISA测定数据的处理

①根据标准Bt蛋白的量和