GB∕ T 40457-2021 咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法（正式版）

ICSCCS65.020.01咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40457—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。1GB/T40457—2021咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法1范围本文件描述了咖啡浆果炭疽病菌形态学和分子生物学特征的鉴定检测方法。本文件适用于携带咖啡浆果炭疽病菌的植物及其产品中咖啡浆果炭疽病菌的检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义4分类信息分类地位：真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),盘菌亚门(Pezizomycotina),粪壳菌纲(Sordar-iomycetes),肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae),小丛壳目(Glomerellales),小丛壳科(Glomerellaceae),刺盘孢属(Colletotrichum)。5鉴定原理态特征和实时荧光PCR特异性反应进行鉴定。6.2试剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液(2%CTAB,1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA,2GB/T40457—2021麦芽汁培养基(MEA):麦芽汁20g,蛋白胨3g,琼脂20g,加蒸馏水配制1L。配成溶液后121℃下灭菌20min。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂粉20g,加蒸馏水配制1L。配成溶液后121℃下灭菌20min。切取发病材料病健交界处的植物组织(约0.3cm×0.3cm),用75%乙醇浸泡1min进行表面消毒，无菌水冲洗3次后置于灭菌滤纸上，吸干水分后放置于倒有麦芽汁培养基(MEA)的培养皿中。培养皿放置在温度为25℃条件下光照培养箱中培养(光照和黑暗各12h交替)。培养4d～6d后，挑取可疑菌落边缘的菌丝进行纯化培养。7.2形态学观察况等(见图A.2)。7.3DNA制备DNA制备按照附录B的方法提取。7.4DNA纯度与浓度的测定用紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别读取260nm和280nm处的吸收值，计为OD₂₆o、OD₂8o。DNA的纯度OD₆o/OD₂so比值应为1.7～1.9,DNA的浓度为50倍的OD₂₆o(μg/mL)。DNA的浓度与纯度应符合实时荧光聚合酶链式反应(Real-timePCR)检测的要求。7.5实时荧光PCR检测实时荧光聚合酶链式反应(Real-timePCR)方法按照附录C的方法检测。8鉴定特征状物。病叶上可见褐色炭疽状病斑，其上有许多黑色小点(病原菌的分生孢子)排列成同心轮纹(见在温度为25℃下，咖啡浆果炭疽菌培养物在2%麦芽汁培养基(MEA)平板上生长7d后，菌落直3GB/T40457—20218.3实时荧光PCR鉴定——样品Ct值大于40时，判定为阴性。9结果判定若症状明显符合8.1鉴定特征，且培养物培养特征符合8.2鉴定特征，判定为检出咖啡浆果炭疽病菌。出咖啡浆果炭疽病菌。保存样品应置于2℃~8℃冰箱妥善保存，对检出咖啡浆果炭疽病菌的样品应至少保存6个月。菌株保存于4℃冷藏箱，核酸样品保存于-20℃或-80℃冰箱。以备复检、谈判和仲裁。分离到的咖啡浆果炭疽病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中妥善保存。荧光PCR要有检测阳性结果照片。由指定的单位或人员负责，主要考察试验原始数据记录及实时荧光PCR结果等资料的完整性和真4GB/T40457—2021(资料性)咖啡浆果炭疽病菌基本信息A.1地理分布A.3传播途径植株相关贸易进行传播。A.4危害情况咖啡浆果炭疽病是一种毁灭性的病害，主要危害小粒种咖啡的绿色浆果和叶片，极易造成果实脱落，并可使咖啡果实产量损失50%～80%。浆果表面初时呈现近圆形水渍状小斑点，后病斑变成凹陷，暗褐色至灰黑色大病斑，其上长出粉红色黏液状物(见图A.1)。图A.1咖啡浆果炭疽病菌危害咖啡叶片和浆果的病害症状(引自Walleretal.1993)A.5形态特征咖啡浆果炭疽病菌培养物形态特征图见图A.2。5GB/T40457—20216(规范性)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取DNA方法(24:1),颠倒混匀后静置至其开始分层。B.6可重复B.4至B.5步2次～3次，视两相界面处杂质的多少而定。B.12加50μL无菌水或三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(TrisEDTA,TE)缓冲液[配方：1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL,加超纯水定容至100mL]溶解沉淀，—20℃贮存备用。GB/T40457—2021(规范性)正向引物CK-GF:5'-CTGCATCTGGTAGACAAGAAGGT-3'。反向引物CK-GR:5'-AGAGCGAGTCAGTAAATGTGACAG-3'。探针CK-GP:5'-CCCATGATTTCAATTCACATCAAGTCAAG-3'。TaqMan探针(CK-GP)采用5′末端FAM(6-carboxy-fluorescein)标记作为荧光报告染料，3'末端TAMRA(6-carboxy-tetramethhylrhodamine)标记作为荧光淬灭染料。应体系混合均匀后置于荧光PCR仪中进行反应。以咖啡浆果炭疽病菌DNA作阳性对照、不含咖啡浆果炭疽病菌的DNA作阴性对照、以无菌蒸馏水作空白对照，每个样品设置3个重复。[1]CaiL,HydeKD,TaylorPWJ,WeirBS,WallerJ,AbangMM,ZhangJZ,YangPhoulivongS,LiuZY,PrihastutiH,ShivasRG,McKenzieEHC,JohnstonPR(2009)ApolyphasicapproachforstudyingColletotrichum.FungalDiver[2]CannonPF,DammU,JohnstonPR,WeirBS(20turedirections.StudMycol73:181-213.[3]LiuF,WeirB,DammU,CrousPW,WangY,LiuB,WangM,ZhangM,CaiL(2015).UnravellingColletotrichumspeciesassociatedwithCamellia:employingApMatandGSloresolvespeciesintheC.gloeosporioidescomplex.Persoonia35:63-86.[4]PrihastutiH,CaiL,ChenH,HydeKD(2009)CharacterizationofColletotrichumspeciesassociatedwithcoffeeberriesinChiangMai,Thailand.FungalDivers39:89-109.[5]SantamariaJ,BaymanP(2005)Fungalepiphytesandendophytesofcoffeeleaves(Coffeaarabica).MicrobEcol50:1-8.[6]SilvaDN,TalhinhasP,VarzeaV,CaiL,PauloOS,BatistaD(2012)ApplicationoftheApn2/MATlocustoimprovethesystematicsoftheColletotrichumgloeosporioidescomplex:anex-amplefromcoffee(Coffeaspp.)hosts.Mycologia104:396-409.[7]SreenivasaprasadS,BrownAE,MillsPR(1993)CoffeeBerryDiseasepathogeninAfr995-1000.[8]TaoG,HydeKD,CaiL(2012)Species-specificreal-timePCRdetectionofColletotrichumkahawae.JApplMicrobiol114(3):828-835.[9]WallerJW,BridgePD,BlackR,HakizaG(1993)Characterizationofthecoffeeberrydiseasepathogens,Colletotr