3.2 基因工程的基本操作程序-2023-2024学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

1.2基因工程的基本操作程序课程导入：基因工程培育抗虫棉的简要过程提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)转基因抗虫棉的培育程序：将重组DNA导入选育棉花细胞内

从具有抗虫性状的细菌DNA分子中获取抗虫基因将抗虫基因与运载体拼接成为重组DNA检测和鉴定抗虫基因在该棉花细胞中表达1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用

载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。前提核心关键保证一、目的基因的获取1、目的基因：主要是指______________________，也可以是一些___________________。编码蛋白质的结构基因具有调控作用的因子（1）什么是基因？（2）基因的作用是什么？请思考：基因是指具有遗传效应的DNA片段。表达遗传信息，控制生物性状。

反义基因是指一段与mRNA或DNA特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的DNA分子。英国科学家将西红柿DNA的反义链用基因工程技术插入西红柿的细胞中，培育出的西红柿品种成熟后，细胞中多聚半乳酸糖醛酶的生成受到了干预，因而这种酶的含量比原来的普通西红柿的含量低了99%。从而使西红柿成熟后不软化，便于运输和贮存。2、获取目的基因的常用方法①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因观察左图，思考：提取目的基因的方法有哪些？（1）从自然界已有的生物材料中分离（2）人工合成方法1：从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。1.基因文库（genelibrary）概念2.基因文库类型基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（包含一种生物的一部分基因）（cDNA文库）提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库基因组文库的构建基因组文库(Genomiclibrary)

是指将某种生物体的全部DNA提取出来，用限制酶切成一定范围大小的DNA片段，分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含一段不同的DNA片段，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶cDNA文库的构建cDNAcDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段；cDNA文库(cDNA

library)

与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较启动子具有种属特异性DNA基因1

基因2

基因3放大基因的结构每个DNA分子含有许多基因，基因在染色体上呈线性排列。（1）原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游编码蛋白质，连续①调控遗传信息的表达，上游有启动子，下游有终止子②不编码蛋白质启动子终止子…………TACACGTGCATCAAT……………………ATGTGCACGTAGTTA…………编码区非编码区非编码区启动子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。

RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质。

终止子：位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。终止子编码区非编码区非编码区（能编码蛋白质）启动子终止子外显子内含子编码蛋白质，不连续（不能编码蛋白质）（2）真核细胞的基因结构（3）原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是_________的编码区是间隔的、_________的相同点都由能够编码蛋白质的__________和具有调控作用的__________区组成的连续不连续编码区非编码相应酶原核细胞中有没有？思考：如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，从基因组文库中获取目的基因，还是从cDNA文库中？（4）真核细胞cDNA的获取不含非编码序列。即不含非编码区和内含子cDNA是mRNA反转录产生的互补DNA（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？

构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，不一定要构建基因文库。但如果：所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。请思考：依据目的基因的有关信息，如根据：基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。（2）如何从基因文库中得到所需要的基因？（1）概念：PCR全称为_________________

，是一项在生物_______复制________________的核酸合成技术。（3）条件：___________________、____________________________、

________________________、_________、_______________________。（2）原理：____________多聚酶链式反应体外特定DNA片段模板（目的基因）四种脱氧核苷酸（dNTP）引物热稳定DNA聚合酶（Taq酶）DNA复制缓冲液（其中需要Mg2+）方法2：利用PCR技术扩增目的基因（4）PCR技术的操作过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_____倍变性退火延伸一Taq酶（thermusaquaticus)/热稳定DNA聚合酶

最初由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌（thermusaquaticus）中提取获得。此酶能耐高温，在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%，因此不必每轮循环时重新加入新酶。（6）方式：以________方式扩增，即_______（n为扩增循环的次数）（7）结果：__________________________________________。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增指数2n（5）前提：__________________________________,以便根据这一序列合成引物。有一段已知目的基因的核苷酸序列（8）仪器：_______________。PCR扩增仪PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术原则场所条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATPdNTP、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等请思考？1、四种脱氧核苷酸就是dNTP吗？dNTP是脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C等中的一种，在PCR中起原料作用。不是请思考？4、1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？2×（2n-1）(n为循环次数)（24-1）×2=302、PCR扩增消耗的能量来源于哪？3、细胞内DNA复制时需要引物么？高温和dNTP需要蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（1）适用条件：在基因较小，核苷酸序列已知。方法3：人工合成（2）方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因。（3）过程：DNA合成仪

不具有，缺少非编码区(启动子、终止子）和非编码序列（如内含子），要人工构建。人工合成的目的基因是否具有完整基因结构的基因？请思考？获取目的基因的方法总结方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)优点操作简单专一性可在短时间内大量扩增目的基因专一性强，可产生自然界中不存在的新基因缺点工作量大、盲目性大、专一性差操作过程较麻烦，技术要求过高需要严格控制温度、技术要求高适用范围小1、若未知目的基因的核苷酸序列，可采用_________________2、若已知目的基因两端的核苷酸序列，且基因比较大，可采用____________

3、若已知目的基因序列，且基因比较小，可采用________________PCR技术扩增化学方法人工合成从基因文库获取的方法选择不同获取目的基因的方法的依据连一连：获取目的基因的方法及适用范围？1.已知核苷酸序列，基因较小a.从基因文库中获取条件方法2.已知核苷酸序列,或部分序列,基因较大3.核苷酸序列未知，无mRNA4.已知相关基因对应的mRNAb.从基因文库中获取或PCRc.从cDNA文库中获取或逆转录后PCRd.人工直接合成寻根问底：

将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？

有人采用总DNA注射法进行遗传转化：即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体细胞，没有进行表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体细胞。此法目前争议颇多，严格来说不算基因工程。（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代（2）使目的基因能表达和发挥作用思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？二、基因表达载体的构建—基因工程的核心1、构建基因表达载体的目的：资料:

科学家在培育抗虫棉时，起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。

然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。

资料说明：目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子等。标记基因2、基因表达载体的组成：鉴别受体细胞中是否含有目的基因;将有目的基因的细胞筛选出来ori，是DNA复制的起点，作用是带动DNA复制问题：为什么要进行筛选？把什么筛选出来？怎样筛选？能够控制特定性状质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA3、基因表达载体的构建过程：质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端限制酶的选择：

在切割目的基因和载体时，要求用同一种限制酶，目的是

，如

。产生相同的黏性末端PstI

也可使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和载体，目的是

，如

。避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接PstI和

EcoRI限制酶的选择标准：（1）选择的限制酶在目的基因和载体上都有其切点（一般不同的限制酶切割形成的黏性末端不同）。（2）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，切点位于目的基因内部的限制酶不能选。（3）目的基因插入载体的位置必须位于启动子和终止子的中间。（4）为确保调控序列的功能，选择的限制酶不能破坏标记基因、启动子、终止子、复制原点等结构。（5）如果所选限制酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则重组DNA进入受体细胞后不能自主复制。①质粒自身环化②目的基因自身环化③目的基因与质粒连接形成重组质粒①自身环化的质粒②自身环化的目的基因③目的基因与质粒连接形成重组质粒④什么都没导入DNA连接酶连接后的结果可能是：导入受体细胞后的结果可能是：空质粒问题：怎样区别自身环化质粒和重组质粒？抗四环素基因抗氨苄青霉素基因外源基因AmpTetAmpAmpTetTet重组DNA空载体没有导入或目的基因环化氨苄青霉素抗性基因（amp）四环素抗性基因（tet）√其他标记基因：

有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识目的基因表达的产物存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因工程载体的构建需要考虑哪些因素（1）基因的特点：①如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。②基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。

既用到限制酶切割载体和目的基因，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。关于构建基因表达载体的易错点分析（1）载体≠表达载体

二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。（2）用到的工具酶：（5）目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。（3）启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。（4）启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始（终止）密码子启动子（终止子）本质位置作用三个相邻碱基DNA片段位于mRNA上位于DNA上启动（终止）翻译启动（终止）转录（一）转化：（三）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞（二）原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法农杆菌的特点:①能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力；③农杆菌中的Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上。②当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞；将目的基因导入植物细胞采用最多的方法转化过程:基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法常用的金属颗粒有钨粉粒子和金粉粒子。特点：①常用于单子叶植物的转化；②成本较高。（3）花粉管通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的。2、将目的基因导入动物细胞方法:显