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大豆疫霉病菌检疫检测与鉴定方法INY/T2114—2012本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。1下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3原理大豆疫霉病菌(PhytophthorasojaeKaufmann&.Gerdemann)属藻菌界(Chromista),卵菌门(Oo-孢子囊及卵孢子形态特征进行鉴定；PCR检测中，利用特异引物对病菌DNA扩增时获得的特异DNA在大豆生长期进行田间症状目测踏查，重点调查田边地头及地势低洼积水处27.3.2叶碟诱捕方法3取种子中青瘪的可疑籽粒，清洗后用10%KOH水溶液浸4h,取种皮在100倍～400倍显微镜下检查是否有卵孢子，以内种皮大豆疫霉病菌卵孢子存在与否为标准。大豆疫霉病菌卵孢子圆形，淡黄褐种子样品不少于1kg,置于低温干燥处至少保存6个月，以备复检。土壤样品不少于100g经室温分离并鉴定为大豆疫霉病菌的菌株可转接到胡萝卜培养基斜面上，置于10℃冰箱中保存，必要时45678NY/T2114—20129NY/T2114—2012表F.1大豆疫霉病菌PCR检测引物引物序列片段大小退火温度ATCTTGGCGACTGAGGCTGCT引物名称194℃5min;94℃30s,60℃30s,294℃5min;94℃30s,60℃30s,394℃5min;94℃30s,44℃30s494℃5min;94℃30s,58℃30s,594℃5min;94℃30s,58℃30s样品PCR扩增产物经凝胶成像系统的紫外光下观察，凝胶上阳性对照出现一条特异性条带(根据以上5种不同引物，特异性位置也不同),而阴性对照或空白对照没有该特异性DNA条带。供试样品G.2.1土壤样品采用FastDNAOSPIN试剂盒进行DNA的提取。G.2.1.1加500mg的土壤到LysingMatrixEtube中。在管中加入978μL的磷酸钠缓冲液和G.2.1.2将LysingMatrixEtube在FastPrep@Instrument以55000g的速度震动40s;同时以NY/T2114—2012

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