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农业部2122号公告一6—2014PCR方法Detectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedp2014-07-07发布2014-08-01实施中华人民共和国农业部I农业部2122号公告—6—20141农业部2122号公告—6—2014耐除草剂苜蓿J163及其衍生品种定性PCR方法本标准适用于转基因耐除草剂苜蓿J163及其衍生品种，以及制品中J163转化体成分的定性PCRGB/T6682分析实验室用水规格和试验方法农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化农业部2031号公告—19—-2013转基因植物及其产品成分检测抽样NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求Acc基因Accgene根据转基因耐除草剂苜蓿J163转化体特异性序列设计特异性引25.12Acc基因引物Acc-F:5'-GATCAGTGAACTTCGCAAAGAcc-R:5'-GAGGGATGCTGCTACTTTJ163-F:5'-CCCCATTTGGACGTGAATJ163-R:5'-CACGTGGTGTGTTAATT5.15石蜡油37.5.1试样PCR反应7.5.1.1每个试样PCR反应设置3次平行。水10×PCR缓冲液dNTPs混合溶液(各2.5mmol/L)25mg/LDNA模板总体积“—”表示体积不确定。如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液。根据TaqDNA聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0μL。注：苜蓿内标准基因PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为Acc-F和Acc-R;J163转化体P中，上、下游引物分别为J163-F和J163-R。7.5.2对照PCR反应4农业部2122号公告—6—2014增片段是否为目的DNA片段，按照7.8和7.9的规定执行。将回收的PCR产物克隆测序，与抗除草剂苜蓿J163转化体特异性序列(参见附录A中A.2)进行阳性对照的PCR反应中，Acc内标准基因8.2.3Acc内标准基因片段未得到扩增9检出限本标准方法的检出限为1g/kg。561ATGCACTCATGTTGTAGTGTTCACGTCGTTGATACATGACCATATAG51GAATAATTTGTTTATTGCTTTCGCCTATAAATACGACGGATCGT101TCGTTTTATCAAAATGTACTTTCAT

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