《医疗器械生物学评价+第5部分：体外细胞毒性试验GBT+16886.5-2017》详细解读

《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验GB/T16886.5-2017》详细解读contents目录1范围2规范性引用文件3术语和定义4样品和对照品制备5细胞系6培养基7贮存培养细胞制备8试验步骤contents目录9试验报告10结果评定附录A(资料性附录)中性红摄取(NRU)细胞毒性试验性附录B(资料性附录)集落形成细胞毒性试验附录C(资料性附录)MTT细胞毒性试验附录D(资料性附录)XTT细胞毒性试验参考文献011范围医疗器械生产企业该标准为医疗器械生产企业在产品设计和生产过程中进行体外细胞毒性试验提供了指导和规范。检测机构对于负责医疗器械安全性和有效性评估的检测机构，该标准提供了体外细胞毒性试验的具体方法和评估准则。适用对象安全性评价通过体外细胞毒性试验，对医疗器械的安全性进行评价，确保其在使用过程中不会对人体细胞产生毒性作用。试验方法标准详细阐述了体外细胞毒性试验的具体方法，包括细胞培养、样品制备、试验操作等步骤。评估准则提供了对试验结果进行解读和评估的准则，帮助企业和检测机构判断医疗器械的细胞毒性情况。涵盖内容022规范性引用文件GB/T16886.1-2011医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验YY/T0466.1-2009医疗器械用于医疗器械标签、标记和提供信息的符号第1部分：通用要求GB15810-2001一次性使用无菌注射器医疗器械相关标准GB/T14233.2-2005医用有机硅材料生物学评价试验方法GB/T16175-1996ISO10993-52009：医疗器械的生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（Biologicalevaluationofmedicaldevices-Part5:Testsforinvitrocytotoxicity）医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法试验方法相关标准GB/Z21720-2008细胞毒性试验质量控制指南WS/T316-2009医疗器械风险管理对医疗器械的应用细胞培养与毒性评价相关标准033术语和定义医疗器械是指用于预防、诊断、治疗、缓解人类疾病、损伤或残疾的设备、器具、器材、材料或其他物品。医疗器械定义根据其用途和特性，医疗器械可分为多种类别，如手术器械、诊断设备、植入物、体外诊断试剂等。分类与用途3.1医疗器械生物学评价意义通过对医疗器械进行生物学评价，可评估其与人体接触后可能产生的生物相容性反应，确保医疗器械的安全性和有效性。评价内容与方法生物学评价包括细胞毒性试验、致敏试验、刺激与迟发型超敏反应试验等多个方面，采用体内外试验相结合的方法进行。3.2生物学评价3.3体外细胞毒性试验试验方法常用的体外细胞毒性试验方法包括细胞增殖度法、细胞形态观察法、细胞毒性分级法等。这些方法可单独或联合使用，以更全面地评估医疗器械的细胞毒性。试验原理体外细胞毒性试验是通过将医疗器械材料或其浸提液与细胞接触，观察细胞生长、增殖及形态变化等指标，以评价材料的细胞毒性。浸提液指将医疗器械材料按一定比例与溶剂混合后，通过一定时间和条件浸提得到的液体。浸提液用于模拟医疗器械与人体接触时可能释放出的物质。细胞毒性3.4相关术语解释指医疗器械材料或其浸提液对细胞生长、增殖和功能产生的不良影响。细胞毒性是评价医疗器械生物相容性的重要指标之一。0102044样品和对照品制备样品来源应明确样品的来源，包括医疗器械材料、加工过程中的中间产物或最终产品等。样品处理样品形状和尺寸4.1样品制备根据试验需求，对样品进行适当的处理，如清洗、消毒、干燥、切割等，确保样品符合试验要求。根据试验方法和细胞类型，选择适当的样品形状和尺寸，以便与细胞充分接触并便于观察。应选择与试验样品相同或相似的材料作为阴性对照，以排除非特异性反应的影响。阴性对照根据需要，选择已知具有细胞毒性的物质作为阳性对照，以验证试验方法的敏感性和可靠性。阳性对照对照品应与试验样品进行相同的处理，以确保试验条件的一致性。对照品处理4.2对照品制备为确保试验过程中样品和对照品的可追溯性，应采用适当的标识方法对它们进行标记。标识方法应详细记录样品和对照品的来源、处理过程、形状、尺寸等信息，以便后续数据分析和结果解释。记录要求4.3样品和对照品的标识与记录储存条件根据样品和对照品的性质，选择适当的储存条件，如温度、湿度、光照等，以确保其稳定性和有效性。运输要求在运输过程中，应采取必要的措施防止样品和对照品受到污染、损坏或变质。4.4样品和对照品的储存与运055细胞系从动物或人体组织直接分离得到的细胞，如成纤维细胞、上皮细胞等。原代细胞传代细胞转化细胞系经过传代培养后的细胞，如人胚肺细胞、小鼠成纤维细胞等。经特定方法转化后的细胞，如SV40转染的细胞系。5.1适用的细胞系选择的细胞系应与医疗器械接触的组织类型相关。相关性原则选择的细胞系应对试验物质敏感，能反映出潜在的细胞毒性。敏感性原则选择的细胞系应具有良好的稳定性和一致性，以保证试验结果的可靠性。稳定性原则5.2细胞系的选择原则010203按照细胞培养的标准操作流程进行细胞的复苏、传代和冻存。细胞复苏与培养采用适当的细胞计数方法和活性检测试剂，确保试验用的细胞数量和质量。细胞计数与活性检测根据细胞系的特性，调整培养基成分、pH值、温度等条件，以保证细胞的最佳生长状态。培养条件优化5.3细胞系的准备与培养01细胞污染防控严格遵循无菌操作规范，防止细菌、真菌等微生物的污染。5.4注意事项02细胞状态监控定期对细胞进行形态学观察和生长曲线测定，确保细胞处于良好的生长状态。03数据记录与分析详细记录试验过程中的各项数据，包括细胞数量、活性、形态等，以便进行后续的数据分析和结果解读。066培养基选择适合试验细胞生长和维持的培养基，确保细胞在培养过程中能够获得必要的营养物质。适用性在试验过程中，应使用相同类型和批次的培养基，以保持试验条件的一致性。一致性6.1培养基的选择根据细胞类型和试验需求，确定培养基的成分和配比，包括氨基酸、维生素、无机盐等。成分与配比在制备培养基时，应严格遵守无菌操作规程，避免微生物污染。无菌操作6.2培养基的制备定期检查培养基的pH值，确保其适合细胞生长。pH值维持适当的渗透压，以保证细胞的正常生理功能。渗透压对制备好的培养基进行无菌性检查，确保无微生物污染。无菌性检查6.3培养基的质量控制VS遵循培养基的使用说明，正确添加和使用培养基。储存条件将培养基储存在适当的温度和湿度条件下，避免受潮和变质。使用方法6.4培养基的使用与储存077贮存培养细胞制备7.1细胞株的选择推荐人二倍体细胞株、小鼠成纤维细胞株等。原则选择已建立稳定传代且生物学特性明确的细胞株。适宜细胞生长和维持的培养基，如DMEM、RPMI1640等。培养基一般控制在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。温度与湿度7.2细胞培养条件传代根据细胞生长速度和密度，及时进行传代操作，以保持细胞活力。冻存采用适宜的冻存液（如含10%DMSO的FBS），在-80℃或液氮中长期保存细胞。7.3细胞传代与冻存7.4细胞复苏与培养定期检查细胞生长状态，及时更换培养基并进行必要的处理。培养从冻存状态中取出细胞，迅速解冻并转移到预热的培养基中。复苏088试验步骤细胞株选择根据试验需求，选择适当的细胞株，如L929小鼠成纤维细胞等。细胞培养按照细胞培养标准操作规程进行细胞复苏、传代和培养。试剂与材料准备准备所需试剂，如培养基、血清、胰酶等，以及试验用医疗器械包装材料样品。8.1试验准备8.2试验操作样品处理将医疗器械包装材料样品按照规定的方法进行提取或浸提，获得试验用浸提液。细胞接种将处于对数生长期的细胞接种于适当的培养容器中，如96孔板。浸提液添加向接种有细胞的培养容器中加入规定量的浸提液，同时设立阴性对照和阳性对照。细胞培养与观察将培养容器置于适当的培养条件下进行培养，并定期观察细胞形态和生长情况。细胞毒性评价根据细胞形态变化、细胞增殖抑制率等指标评价医疗器械包装材料的细胞毒性。018.3结果评价结果判定按照相关标准或规定对试验结果进行判定，如细胞毒性分级等。02试验数据记录详细记录试验过程中的各项数据，包括细胞接种数量、浸提液添加量、观察时间等。结果分析与讨论对试验结果进行深入分析和讨论，探讨可能的影响因素及改进措施。试验结论根据试验结果和评价，得出医疗器械包装材料体外细胞毒性试验的结论。8.4试验报告099试验报告9.1报告内容试验原理说明体外细胞毒性试验的基本原理和方法，包括细胞培养、样品制备、暴露时间等。材料与方法结果与讨论详细描述试验过程中使用的材料、设备和方法，包括细胞系的选择、培养条件、样品的处理和暴露方式等。提供细胞毒性试验结果，包括细胞形态学观察、细胞增殖和细胞毒性等方面的数据，并对结果进行解释和讨论。附录提供相关数据和图表，以便读者更深入地了解试验结果。摘要简要概括试验的目的、方法、结果和结论，方便读者快速了解报告核心内容。结论与建议根据试验结果，给出明确的结论和可能的改进建议。正文按照上述“9.1报告内容”中的要点，详细撰写试验报告。标题页包括试验报告的名称、试验日期、试验人员等信息。9.2报告格式9.3报告审核与签发审核流程试验报告应经过试验人员、项目负责人和质量保证部门的审核，确保报告的准确性和完整性。签发与存档审核通过的试验报告应由相关负责人签发，并加盖单位公章。同时，报告应进行存档备查。9.4注意事项010203保密性由于医疗器械的生物学评价涉及商业机密，试验报告应注意保密，避免泄露相关信息。法规符合性试验报告应符合相关法规和标准的要求，以确保医疗器械的安全性和有效性。持续改进针对试验中发现的问题，应持续改进试验方法和技术，提高评价的准确性和可靠性。1010结果评定细胞形态学观察通过显微镜观察细胞形态的变化，评估医疗器械对细胞是否有毒性作用。细胞相对增殖率通过计算细胞相对增殖率，判断医疗器械对细胞生长的影响。评定标准评定流程试验前准备确保试验器械无菌，准备好所需的试剂和设备，设置好对照组和实验组。按照标准规定的方法进行细胞接种、器械浸提液制备、细胞暴露等操作。试验操作在规定的时间点观察并记录细胞的形态学变化和增殖情况。结果观察与记录无毒性如果细胞形态正常，相对增殖率≥100%，则认为医疗器械无细胞毒性。轻度毒性如果细胞形态轻微变化，相对增殖率在75%~99%之间，则认为医疗器械有轻度细胞毒性。中度毒性如果细胞形态明显变化，相对增殖率在50%~74%之间，则认为医疗器械有中度细胞毒性。重度毒性如果细胞形态严重变化，相对增殖率＜50%，则认为医疗器械有重度细胞毒性。结果解释试验过程中要确保无菌操作，避免污染对结果的影响。注意事项要严格按照标准规定的方法进行试验，确保结果的准确性和可靠性。在结果评定时要综合考虑细胞形态学观察和相对增殖率两个指标，避免单一指标的片面性。11附录A(资料性附录)中性红摄取(NRU)细胞毒性试验性细胞毒性评价通过检测细胞对中性红的摄取能力，评估医疗器械材料对细胞的潜在毒性作用。中性红特性中性红是一种活细胞染料，可被正常细胞摄取并积聚在溶酶体内，其摄取量可反映细胞的活力和数量。试验原理根据试验需求，准备相应的医疗器械材料样本。医疗器械材料选择高质量的中性红染料，确保试验结果的准确性。中性红染料01020304选择适宜的细胞系进行试验，如小鼠成纤维细胞(L929)等。细胞系包括细胞培养基、显微镜、分光光度计等必要的试剂和设备。其他试剂与设备试验材料结果分析根据细胞对中性红的摄取量，判断医疗器械材料的细胞毒性程度。可设定不同的毒性分级标准，如无毒、轻度毒性、中度毒性和重度毒性等。细胞培养将选定的细胞系接种于适宜的培养基中，进行预培养。材料处理将医疗器械材料样本进行处理，如制备浸提液或直接与细胞接触。中性红摄取试验向细胞培养物中加入中性红染料，继续培养一定时间后，观察并测定细胞对中性红的摄取情况。试验方法试验过程中应严格遵守无菌操作规范，避免微生物污染对试验结果的影响。合理设置试验对照组，以便准确评估医疗器械材料的细胞毒性作用。选择适宜的细胞系和医疗器械材料样本，确保试验结果的代表性和可靠性。根据实际情况调整试验参数和条件，以获得更为准确和全面的评价结果。注意事项12附录B(资料性附录)集落形成细胞毒性试验试验原理观察细胞在受试材料作用下的增殖与分化情况，以判断材料的生物相容性。细胞增殖与分化通过检测细胞集落的形成能力来评估医疗器械包装材料的细胞毒性。集落形成细胞毒性试验将细胞接种在受试材料表面，进行培养并观察细胞生长情况。细胞接种与培养试验步骤在培养一定时间后，观察并记录细胞集落的数量、大小和形态。集落形成观察对观察到的集落进行统计分析，评估受试材料的细胞毒性。数据分析结果解读无毒性反应若细胞在受试材料表面正常增殖并形成集落，说明材料无明显的细胞毒性。轻度毒性反应若细胞增殖受到一定抑制，但仍能形成一定数量的集落，说明材料可能具有一定的细胞毒性，但毒性较低。重度毒性反应若细胞增殖受到严重抑制，无法形成集落或集落数量极少，说明材料具有明显的细胞毒性。选择适当的细胞类型进行试验，以更好地模拟实际使用情况下的生物相容性。细胞选择为确保结果的可靠性，建议进行多次重复试验并取平均值进行数据分析。重复试验确保试验过程中的温度、湿度、pH值等条件符合标准要求，以保证试验结果的准确性。试验条件控制注意事项13附录C(资料性附录)MTT细胞毒性试验MTT法原理MTT是一种黄颜色的染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。细胞毒性评价试验原理通过测定细胞代谢活性的变化，可反映材料对细胞造成的毒性损害程度。0102提取液与细胞共培养：将不同浓度的提取液加入细胞培养体系中，与细胞共培养一定时间。细胞接种与培养：将试验细胞接种到适当的培养容器中，加入培养基进行预培养。结晶溶解与吸光度测定：去除上清液，加入DMSO等溶剂溶解甲瓒结晶，通过酶标仪测定各孔吸光度值。医疗器械材料提取液制备：按照相关标准制备医疗器械材料的提取液。MTT溶液加入与孵育：培养结束后，加入MTT溶液并继续孵育一定时间。试验步骤细胞存活率计算根据吸光度值计算细胞存活率，以评价医疗器械材料的细胞毒性。毒性分级与评价根据细胞存活率对医疗器械材料的毒性进行分级评价，如无毒、轻度毒性、中度毒性和重度毒性等。结果分析与评价试验条件控制为确保试验结果的准确性和可靠性，应严格控制试验条件，如细胞种类、接种密度、培养时间等。MTT法局限性MTT法虽然具有操作简便、灵敏度高等优点，但也存在一定的局限性，如不能区分细胞死亡类型、易受多种因素影响等。因此，在实际应用中需结合其他评价方法进行综合评估。注意事项与局限性14附录D(资料性附录)XTT细胞毒性试验XTT试验原理XTT（2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide）是一种四唑盐，可被活细胞线粒体中的脱