SNT 4419.13-2016 出口食品常见过敏原LAMP系统检测方法 第13部分：葵花籽

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准第13部分：葵花籽I本部分为SN/T4419的第13部分。1出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法第13部分：葵花籽SN/T4419的本部分规定了出口食2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidLAMP:环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplifiTritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚4防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403—2008中附录D的规定。2增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原葵花籽成分。6LAMP检测方法根据葵花籽HaG5基因序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，特异性识别靶序列上的6个独立区域，在链置换型BstDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异靶序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物(焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。显色液显色原理：SYBRGreenI是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到dsDNA的小沟内。当它与dsDNA结合时，荧光信号是游离状态的800-1000倍。在不发生扩增反应时，SYBRGreenI染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着dsDNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表dsDNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2仪器和设备6.2.1水浴锅或加热模板：63℃±1℃和80℃±1℃。6.2.3计时器。6.3试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2CTAB提取缓冲液(20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/L6.3.3CTAB沉淀液(5g/LCTAB,406.3.5蛋白酶K(20mg/mL)。6.3.7BstDNA聚合酶：酶浓度6.3.11显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000×。6.3.12引物：根据葵花籽HaG5基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3,内引物FIP/BIP,环引物FLP/BLP,见表1。3名称编号序列LAMP引物序列外侧上游引物(F3)外侧下游引物(B3)5’-GGATATCGATATTGCTCTCGG-3’5'-GTTGCTGTTGTACTTGCTGCTGAAACATCGAAGGGCAGTG-3’5'-GGTTCGCAGCAGACCCAATGAAGGTTGCATACGTTAGG-3’上游环引物(FLP)5'-TCGGAACACCTGCTTCAC-3’下游环引物(BLP)5'-TTGAAGCAGAAGGCTCAGATT-3’——LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。4外侧上游引物(F3)外侧下游引物(B3)内侧上游引物(FIP)内侧下游引物(BIP)上游环引物(FLP)下游环引物(BLP)41(包括缓冲液中所含硫酸镁)12水现非下述正常结果，应重做实验：7结果判断和确证7.1待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结7.2待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品56(资料性附录)扩增产物参考序列CTCCAGCAGTGTTGTCAAGAGCTCCAAAACATCGAAGGGCAGTGCCAAAAGCAGGTGTTCCGAGAAGCCCAGCAGCAAGTACAACAGCAACAGGGACGGCACCCTTCCGCGGT