3.2基因工程的基本操作程序（第二课时）课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章基因工程第2节基因工程的基本操作程序（第二课时）目录/CONTENTS01目的基因的筛选与获取02基因表达载体的构建03将目的基因导入受体细胞04目的基因的检测与鉴定学习目标：1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。旧识回顾二、基因表达载体的构建1.基因表达载体的构建的目的？载体还需要哪些结构？各个元件有什么作用？2.目的基因插入什么位置？目的基因插入位点是随意的吗？3.请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。4.使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？如果不能，怎么改进？合作探究：请同学们自主阅读教材，小组合作思考讨论完成问题。

目录02二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建问题:获取了足够量的目的基因后，能直接把目的基因导入受体细胞吗？就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解

那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？二、基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的目的①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代;

②使目的基因能够表达和发挥作用思考：要各个元件有什么作用？2.基因表达载体的组成构建基因表达载体是基因工程的核心。二、基因表达载体的构建目的基因：能控制表达所需要的特殊性状(必须插到启动子和终止子之间)复制原点：DNA复制的起始位点终止子：本质：有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的下游功能：终止转录四环素抗性基因、荧光蛋白基因等启动子：本质：有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来二、基因表达载体的构建提问：目的基因该插入什么位置？目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入

，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。启动子和终止子之间的部位当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。诱导型启动子：诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达诱导型启动子：二、基因表达载体的构建提问：辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”。项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)提问：请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。二、基因表达载体的构建3.基因表达载体构建的过程：质粒载体限制酶目的基因限制酶切割位点限制酶切割位点限制酶在构建抗虫棉的基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段DNA连接酶重组DNA分子基因表达载体（核心工作）二、基因表达载体的构建问题探讨：1、使用一种限制酶进行切割（单酶切），是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？单酶切：选择一种限制酶同时对目的基因和质粒切割。同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同末端的一类限制酶。

单酶切的缺点（效率不高）:①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接正向连接反向连接122’1’22’1’1二、基因表达载体的构建问题探讨：2、如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？双酶切的优点:①

防止质粒重新环化②防止目的基因自身环化③

防止质粒与目的基因反向连接双酶切：选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割二、基因表达载体的构建限制酶的选择原则(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中

；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择

和

两种限制酶。(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择

，而不选择

。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择

。PstⅠSmaⅠSmaⅠPstⅠPstⅠEcoRⅠ二、基因表达载体的构建基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取 (

)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(

)标记基因不一定是抗生素抗性基因(

)当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制目的基因的表达(

)

××√√1.目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为

。

(2)用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是

。

(3)构建基因表达载体时,可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA,但会导致

等问题,为避免以上问题出现,应使用

两种限制酶。

SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因目的基因自身环化、目的基因不能定向连接BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)限制酶和DNA连接酶(4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上

,其是

识别和结合的部位。

RNA聚合酶启动子二、基因表达载体的构建2.某目基因两侧的DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示,下列可作该目的基因最佳载体的是 (

)

A

BC

DA二、基因表达载体的构建3.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是(

)A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别A二、基因表达载体的构建4.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（）A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别B二、基因表达载体的构建5.图A、图B分别表示质粒和外源DNA，其中箭头表示相关限制酶的酶切位点，下列叙述正确的是(

)A.用质粒和外源DNA构建重组质粒过程中，不能使用SmaⅠ切割B.图A所示的质粒分子在经SmaⅠ酶切割后含有4个游离的磷酸基团C.为获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA聚合酶D.用EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ中的任意一种酶切割质粒和外源基因都可以A二、基因表达载体的构建6.在基因表达载体的构建中,下列说法正确的是 (

)①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止④所有基因表达载体的构建是完全相同的⑤必须在细胞外进行A.②③⑤ B.①④ C.①②⑤ D.③④A目录03三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞合作探究：请同学们自主阅读教材P81，小组合作思考讨论完成问题。

1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？各自适用于什么生物？2.农杆菌的特点？农杆菌转化法的原理。3.请文字和箭头表示农杆菌转化法的过程。三、将目的基因导入受体细胞1.转化将目的基因导入受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。基因表达载体受体细胞导入动物植物微生物三、将目的基因导入受体细胞2.转化的受体细胞将目的基因导入受体细胞受体细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法（我国科学家独创）（常用）三、将目的基因导入受体细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法）1.目的基因导入植物细胞含目的基因的DNA溶液方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液（含构建好的基因表达载体的溶液）直接注入子房中三、将目的基因导入受体细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创）1.目的基因导入植物细胞方法二：在植物受粉后的一定时间内，花粉管还没有愈合前，剪去柱头，将DNA（含目的基因）溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。适用生物：开花植物三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法（常用）1.目的基因导入植物细胞①农杆菌特点：是一种微生物，自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法（常用）1.目的基因导入植物细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。②原理：农杆菌细胞内含有

，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的

可转移至被侵染的植物细胞，并整合到该植物细胞的

。T-DNA染色体DNA上Ti质粒思考：构建基因表达载体时，目的基因该插到Ti质粒哪里？T—DNA上（可转移的DNA）三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法（常用）③过程：T-DNA目的基因构建表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞表现出新性状的植物植物细胞将目的基因插入染色体DNA中植物组织培养三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法（常用）1.目的基因导入植物细胞目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法（常用）1.目的基因导入植物细胞1.两次拼接第一次拼接：第二次拼接(非人工操作)：2.两次导入第一次导入：第二次导入(非人工操作)：导入的植物的受体细胞可以是什么细胞呢？目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

第1次拼接第2次拼接第1次导入第2次导入三、将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法（常用）1.目的基因导入植物细胞④具体转化方法：a.可以将从新鲜的叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。导入的植物的受体细胞可以是什么细胞呢？三、将目的基因导入受体细胞2.目的基因导入动物细胞（1）常用方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵思考：为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？①

体积大，易操作。②

全能性高，易培养成完整个体。（3）过程:构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物三、将目的基因导入受体细胞2.目的基因导入动物细胞了解：病毒介导法:科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。三、将目的基因导入受体细胞3.目的基因导入微生物细胞（1）常用方法：Ca2+处理法Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。Ca2+（CaCl2溶液）感受态细胞吸收（2）受体细胞:微生物（常用大肠杆菌）优点：①繁殖快②多为单细胞③遗传物质相对较少三、将目的基因导入受体细胞实例：利用转基因大肠杆菌生产药物Ca2+处理大肠杆菌细胞感受态细胞(细胞膜通透性增强)基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子（3）过程:注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常