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文档简介
ICS65.020.30CCSB43ICS65.020.30CCSB43天 津 市 地 方 标 准DB12/T1328—2024PCRDetectionoftypicalpathogenicbacteriainlivestockwaste—TripledigitalPCRmethod2024-07-01发布 2024-09-01实施天津市场监理委员会 发布DB12/T1328DB12/T1328—2024II前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。DB12/T1328DB12/T1328—2024PAGEPAGE1畜禽养殖粪污中典型致病菌检测三重数字PCR法范围本文件规定了畜禽养殖粪污中典型致病菌的三重数字PCR检测方法的原理、试剂和材料、仪器设备、操作步骤、结果分析与表述及生物安全措施。本文件适用于天津市畜禽养殖粪污中金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌的快速定量检测。(GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB19489—2008实验室生物安全通用要求GB/T25171—2023畜禽养殖环境与废弃物管理术语GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27522—2023畜禽养殖污水监测技术规范SN/T4853转基因大米定量检测数字PCR法SN/T5334.1—2020转基因植物产品的数字PCR检测方法第1部分:通用要求与定义GB/T25171—2023、SN/T5334.1—2020界定的术语和定义适用于本文件。原理PCR2DnucO157:H7的rfbEFimYPCR微滴生成系统;b)PCR4℃8℃,12000g/min;e)0.01f)恒温水浴箱:95℃±1℃;g)湿热高压蒸汽灭菌器;h)28℃±1℃37℃±1125r/min250r/min;i)j)k)冰箱:控温0℃4℃;l)超低温冰箱:控温-20℃-80℃;m)微量移液器:0.5μL10μL,20μL200μL,100μL1000μL;n)超微量紫外分光光度计;o)无菌离心管:1.5mL,15mL,50mL。GB/T6682—20085×dPCR裂解液:2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),100mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane,1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacidHClpHDNAoffnucnuc5’-CCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3’nuc5’-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAACT-3’nuc5’-(HEX)TGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATG-(BHQ1)-3’O157:H7rfbErfbE5’-TCAAAAGGAAACTATATTCAGAAGTTTGA-3’rfbE5’-CGATATACCTAACGCTAACAAAGCTAA-3’rfbE5’-(CY5)-AATAAATTTGCGGAACAAAACCATGTGCAA(BHQ3)-3’FimYFimY5’-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3’FimY5’-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3’FimY5’-(FAM)-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT(BHQ1)-3’采样容器应经121℃、20min高压灭菌或使用一次性无菌器具。其余采用所用工具、文具和安全防护用品等应按照GB/T27522—2023中第7章规定执行。参照GB/T36197进行畜禽养殖粪污样品的采集。424-80DNA7.1-7.33.0g5mL15mL9515min2310000min0.6000g/min,4℃8℃5min75%,12000g/min,4℃8℃5min20μL一级水-20DNADNADNADNADNA浓度的测量方法和对DNA模板浓度的要求应符合SN/T4853的规定。PCR在试剂配制区进行ddPCR体系配置。畜禽养殖粪污中同时检测金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:CR(25L表1 数字PCR应系试剂成分体积(μL)5×dPCR预混液5.0nuc上游引物(10μmol/L)1.0nuc下游引物(10μmol/L)1.0nuc探针(10μmol/L)0.5rfbE上游引物(10μmol/L)1.0rfbE下游引物(10μmol/L)1.0rfbE探针(10μmol/L)0.5FimY上游引物(10μmol/L)1.0FimY下游引物(10μmol/L)1.0FimY探针(10μmol/L)0.5DNA模板(1100ng/μL)5.0一级水5.0荧光素钠盐(1μmol/L)2.5每次检测应设置空白对照和阳性对照。空白对照(阴性对照)用一级水替代样品DNA。阳性对照采用阳性质粒标准品。每个待检样品提取的DNA溶液以及空白和阳性对照都应进行3个平行样本的检测。nucrfbEFimYPCR在样本制备区进行,利用微滴生成扩增系统完成25μL反应体系分割和PCR反应。反应条件:95℃,5min,1个循环;95℃,15s,60℃,1min,45个循环;98℃,5min,1个循环;4℃保存反应产物。整体反应期间升降温度速度均为1℃/s。利用微滴阅读分析系统对数字PCR反应进行荧光信息采集和分析。PCR同时满足以下条件,实验为有效:数字PCR60%;(O157:H7)<1;(O157:H7有1;3251:式中:
𝐶=
× ××
×𝑀 ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)𝐶——畜禽粪污样品中某一典型致病菌含量(拷贝数/mL);𝑁𝑚𝑒𝑎𝑛——25μL反应体系中测得核酸拷贝值的平均值(拷贝数);𝑉1——提取DNA的终体积(μL);𝑉2——ddPCR反应体系中加入的DNA模板体积(μL);𝑉3——提取DNA时吸取的样品体积(mL);-1𝑑——用于提取畜禽粪污DNA样品的稀释倍数,如样品稀释10倍则为10;-1𝑀——DNA模板的稀释倍数FAM()FAM(1)XXX/mL。HEXHEX(1)XXX/mLCY5(O157:H7。CY5O157:H7(1)O157:H7XXX/mLGB/T27403—2008DGB1948912120min三重微滴式数字PCR检测三种致病菌的定量方法检测限分别为:沙门氏菌6.97copies/µL;金黄色葡萄球菌7.57copies/µL;大肠埃希氏菌O157:H77.66copies/µL。检出限分别为沙门氏菌0.68copies/µL;金黄色葡萄球菌1.02copies/µL;大肠埃希氏菌O157:H71.02copies/µL。参 考 文 献GB/T36197SN/T2206.11—201411PCR法SharmaVK.Real-timereversetranscri
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