GBT 35939-2018 脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法

GB/T35939—2018脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局GB/T35939—2018本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。1GB/T35939—2018脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法本标准规定了脑心肌炎病毒间接ELISA抗体的检测方法。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则3缩略语BSA:牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin)ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)EMCV:脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus)HRP-SPA:辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(HorseradishperoxidaselabeledstaphylococcalproteinA)TMB:四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine)VP1:病毒结构蛋白1(Viralprotein1)2GB/T35939—20184.3.1重组EMCVVP1抗原(制备方法见附录B中的B.1)。4.3.2EMCV阳性血清和EMCV阴性血清(制备方法见附录B.2)。4.3.3HRP-SPA。4.3.4TMB(见附录C)。4.3.5商品化EMCV抗体检测试剂盒。5EMCV间接ELISA抗体检测方法c)封闭：加入含5%脱脂乳粉的PBST,200μL/孔，置37℃下封闭2h;作1:50倍稀释。混匀后分别取100μL依次加入间接ELISA板反应孔中，每份血清加两个孔。每块5.2.4加酶标记抗体和孵育：加入PBST稀释工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗体(HRP-SPA)3GB/T35939—2018(1:3000稀释),100pL/孔，37℃孵育0.5h。5.2.5洗涤同5.2.1b)。5.2.6加底物缓冲液和孵育：每孔加新配制的底物溶液(见C.6)100μL,37℃避光孵育5min～15min(参见附录D)。5.2.7终止反应见阳性对照血清孔呈鲜明的蓝色，阴性对照血清孔无色或基本无色，加入2mol/LH₂SO₄溶液(见C.7),50μL/孔，终止反应。5.2.8酶标反应板在波长为450nm的酶联免疫吸附仪下读取各孔的OD值，15min内完成。5.3结果判定5.3.1结果计算P/N计算，P/N=被检血清的两孔平均OD₄50值/阴性对照血清的两孔平均OD₄₅0值。阳性对照血清平均OD₄50值≥0.5,阴性血清两孔平均OD₄50值≤0.2,判定试验条件成立。当P/N≥2.1,判为阳性，P/N<2.1则判为阴性。或使用商品化EMCV抗体检测试剂盒，其操作和判定按其说明书进行。4GB/T35939—2018(资料性附录)脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)引起的多种脊椎动物共患的传染病，以脑炎、心肌炎以及心肌周围炎为主要特征。猪和鼠是受感染最普遍的动物。临床上可引起仔猪急性致死性心肌炎和脑炎及母猪繁殖障碍等疾病。人可呈现轻度脑炎临诊症状。1960年巴拿马首次比利时和塞浦路斯多次暴发流行，引起严重经济损失。我国于2007年在发病猪群中也发现脑心肌炎病例，并分离到病毒，但常表现为亚临床感染。本病实验室诊断方法有小鼠感染试验、病毒分离鉴定、RT-PCR方法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、血清中和试验和间接免疫荧光试验等。5GB/T35939—2018(规范性附录)抗原抗体的制备B.1重组EMCVVP1抗原制备B.1.1菌种表达EMCVVP1抗原蛋白的菌种为BL21-VP1,由EMCVVP1基因原核表达质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)获得。B.1.2菌液培养取BL21-VP1种子液按培养基体积1%量接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，200r/min,37℃摇床振荡培养1.5h～2h,菌液浓度ODsoonm值达到1时，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG,37℃振荡培养8h。B.1.3重组蛋白的表达及纯化统试剂盒说明书，在变性条件下纯化重组融合蛋白EMCvVP1。B.1.3.2重组菌裂解液的制备具体制备过程如下：a)将胍盐细胞裂解缓冲液的pH调至7.8,并于37℃预热；b)100mLLB液体培养基表达的重组菌液，7000r/min离心10min,收集菌体沉淀；c)用8mL胍盐细胞裂解缓冲液，pH7.8条件下重悬上述菌体，室温下震摇5min~10min,使菌体充分裂解；d)在功率200W的条件下超声波裂解细菌，超声裂解5s,停顿5s,直至菌液变得清澈，在冰盒上操作；e)将上述裂解物4℃8000r/min离心10min,沉淀菌体碎片，将上清转移至新的离心管中。B.1.3.3亲和层析柱的准备具体准备过程如下：a)检查柱子下端的帽子完好无破损；b)从4℃冰箱取出树脂小瓶，颠倒重悬树脂使均匀；d)加入6mL无菌去离子水，上下颠倒使树脂重悬、再自然下沉后缓缓吸出上清；f)重复d)～e)2次。具体纯化方法如下：6GB/T35939—2018c)加入4mL结合缓冲液(pH7.8)重悬树脂，充分震摇2min,使树脂自然下沉，缓缓吸出上清，重复本步骤2次；d)加入4mL洗涤缓冲液(pH6.0)重悬树脂，充分震摇2min,使树脂自然下沉，缓缓吸出上清，重复本步骤1次～2次；e)加入4mL洗脱缓冲液(pH5.3)重悬树脂，充分震摇2min,使树脂自然下沉，缓缓吸出上清，重复本步骤1次～2次；10管收集洗脱的蛋白。紫外分光光度计测蛋白浓度。100℃煮沸5min,立即置冰上1min～2min,上样前瞬时离心，吸取上清，用12%的丙烯酰胺SDS-度，纯度不低于90%。B.1.4.2蛋白抗原性鉴定：上述恒压下，转印45min,使目的条带转印至NC膜上。用PBST配制的5%的脱脂乳封闭2h,PBST洗涤洗涤，再加1:20000稀释的羊抗鼠IgGB.1.4.3蛋白浓度的测定：用紫外分光光度计分别测定包被抗原在280nm和260nm波长时的光吸收B.1.4.4蛋白免疫学活性鉴定：采用ELISA方法对抗原的免疫学活性进行鉴定。用抗原包被液将纯化B.1.5分装及保存将合格的蛋白分装到1.5mL微量离心管中，分装量为1mL/管，置-70℃下保存，有效期为12个月。避免反复冻融和污染。B.2EMCV对照血清制备B.2.1.1血清来源动物：4周龄～5周龄健康EMCV抗原和抗体双阴性猪(ELISA检测血清中EMCVEMCV抗体，中和抗体效价≥1:32时，即可用于采血并分离血清。7GB/T35939—2018B.2.2EMCV阴性对照血清稀释液适量稀释，用0.45μm滤膜过滤除菌，置一70℃以下保存，避免反复冻融和污染，有效期24个月。8GB/T35939—2018(规范性附录)溶液的配制C.1抗原包被液(pH9.6,0.05moL/L)称取Na₂CO₃1.59g、NaHCO₃2.93g,加去离子水800mL,用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调至pH9.6,加去离子水定容至1000mL。称取BSA0.5g、蔗糖2g,加去离子水溶解并定容至100mL,0.22μm滤膜过滤，分装后2℃~8℃备用。C.4样品稀释液取NaCl8g、KH₂PO₄·2H₂O0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O2.9g、KCl0.2g和Tween-200.5mL,溶瓶。2℃~8℃下保存。取NaCl80g、KH₂PO₄·2H₂O2g、Na₂HPO₄·12H₂O29g、KCl2g、Tween-205mL,加入瓶。2℃~8℃下保存。洗涤液配制：将10倍浓缩洗涤液恢复至室温，并摇动使沉淀溶解(或于37℃水浴锅中加热5min~10min),然后用去离子水作10倍稀释，混匀，稀释好的洗