猪链球菌病诊断技术 编制说明

1链球菌病相关国标和行标（GB/T1试验操作规程；GB/T19915.2－2005猪链球菌2型分离鉴定操作规程；GB/T-2005猪链球菌2型荧光PCR检测方法；GB/T19915.8－2005猪链球菌2型的《猪链球菌病诊断技术》标准。为此，由南2341、标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，注重2、标准编制格式符合GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准的结3、本次标准的修订主要以原国家《GB/T19试管凝集试验操作规程》、《GB/T19915.2－2005猪链球菌2型分离鉴定操作规程》、《GB/T19915.3－2005猪链球菌2型PCR定型检测技术》、《GB/T19915.4-2005猪链球菌2型三重PCR检测方法》、《GB/T19915.5－2005猪链球菌2型多5保存与运输，马链球菌兽疫亚种、猪链球菌等主要致病菌普通和荧光PCR方法、主要内容包括技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等。要求，之前的规范和标准已不能适应新形势球菌兽疫亚种的检测，除了PCR方法，还增加了敏感性控技术研究与示范》（200803016）和《猪链球菌病防控技术研究与示范》（201303041）项目，围绕猪链球菌病应急防控、流行病学调查、致病机制、检学技术二等奖，山东省农牧渔业丰收奖成果奖二等奖、四川省科学技术三等奖，6——增加了猪链球菌通用PCR试验（见5——增加了猪链球菌7型PCR试验（见6——增加了猪链球菌9型PCR试验（见6——增加了猪链球菌通用荧光PCR试验（见5——增加了猪链球菌2型荧光PCR试验（见6——增加了猪链球菌7型荧光PCR试验（见6——增加了猪链球菌9型荧光PCR试验（见6——增加了马链球菌兽疫亚种PCR试验（见6——增加了马链球菌兽疫亚种荧光PCR试验（见57Diseasesofswine,2019:934-950.）等文献方法，同时依据中华人民共和国农业行业标准《猪链球菌病监测技术规范》（NY/T《猪2型链球菌病防治技术规范》（DB51/T1103—2018）等标准中的相关描述，Streptococcosis[J].Diseasesofswine,2019:934-950.）等文献方法，同时参考发现疑似链球菌病病例时，应在同一猪群的不同个体或同一个体不同组织中分离；因该菌在健康猪肺中存在，故患败血症的病猪应优先从采取肺脏以外的其它组织进行分离；患有脑膜炎病猪，应采取脑脊液进行分离培养。8（1）采样前的准备。采样人员应具备相应的专业知识和采样的基本技能；Streptococcosis[J].Diseasesofswine,2019:934-950.《伯杰氏系统细菌学ManualofSystematicBacteriology,SecondEdition,VolumeThree,TheFirmicutes[M].Heidelberg:Springer.2009：655-710.《兽医微生物学》第六版（陆承平，刘永杰.2021.兽医微生物学[M].第6版.北京：中国农业出版，9分离猪链球菌时采用THB选择性增菌液培养基和THB绵羊血平板选择性培养基。个卵圆形，在液体培养中才呈短链状。马链球菌兽疫亚种菌株大部分菌株形成左右，产生明显的β溶血。革兰氏染色均为阳性链状球菌，固体培养基中呈短链排列，液体中细菌呈8~12节长链状排列。2014-2015年在广州周边地区共采集488份屠宰猪群扁桃体样品和）；病的仔猪气管中分离出1株猪链球菌强毒株，命名为SS2011GZ（畜牧与兽）；）；其分解或利用糖类等，建立其生化鉴定方法。方法建立的主要参考《伯杰氏系统细菌学手册》，第二版，第三卷（2009年VosPD,GarrityGM.,JonesD.,etal.Bergey’sManualofSystematicBacteriology,SecondEdition,VolumeThree,TheFirmicutes[M].Heidelberg:Springer.2009：655-710.）；《兽医微生物学》第六版（陆承平，刘永杰.2021.兽医微生物学[M].第6版.北京：中国生化反应是定性反应，结果以阳性（+阴性（-）和产气（O）显示。微量生化试验可用于链球菌的细菌鉴定，并己积累了大量的经验，但链球菌生验最好还是与血清学、PCR等鉴定方法结合起来。大多猪链球菌菌株具有下述特性：在富含淀粉的培养基中能产生淀粉酶，VP反应阴性，6.5%NaCl抑制其生长，不能还原0.1%的美蓝，能发酵菊粉和棉子糖，七叶苷水解阳性，粉的培养基中能产生淀粉酶，V-P反应阴性，6.5%Nacl抑制其生长，不见表4-1，目前已开发出商业化鉴定系统用于临床链球菌分离株的鉴定，见表4-2。但由于链球菌生化特征变化较大，所以只能作菌种D--G--C--S.dysgalactiaessp.equis--C--S.equissp.zooepidemicusS.equissp.equisimilisC类猪链球菌S.ρorcinusD-----肺炎链球菌S.pneumoniae---化脓链球菌S.pyogenesA--R、S---+bioMerieuxbioMerieuxbioMerieux），条和全自动生化分析仪对各代次之间进行了比较鉴定，结果表明传代稳定性好）；）；GottschalkM.AnupdateonStreptococcussuisidentification[J].JournalofVeterinaryDInvestigation,1990,2(3):249-25作为抗原进行多次重复免疫清洁级新西兰白兔，可获得猪链球菌2型、7型和9型参考菌株的高免血清（与浓度为4×109cfu/mL的参考菌株进行试管凝集，效价应清的制备及应用》，应用该特异性定型建立了猪链球菌2型、123456789NCTC10446NT77Pathogens2016,5(3).编本试验对猪链球菌、马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、多动物链球菌、嗜（M：Trans2Kmark；1：猪链球菌；2：马链球菌气单胞菌；6：肺炎克雷伯菌；7：停乳链参考文献（OkuraM,etal.,:GeneticanalysisofcapsularpolysaccharidesynthesisgeneclustersfromallserotypesofStreptococcusforgenerationofcapsularvariation.Appliedandenvironme因的479-483bp位置序列为5’-CCTGG-3’，可被限制性核酸内切酶MvaI识别，进行猪链球菌2型的鉴定，以cpsK基因片段的限制性核图7-2猪链球菌2型cpsK片段经酶切试验 对实验室收集的378份屠宰场健康猪扁桃体进行猪链球菌的分离培养及血通过分子杂交技术对比猪链球菌不同血清型菌株荚膜多糖合成相关基因簇的GenBank公布的猪链球菌cps7H基因序列（JX986796.1设计了针对猪链球菌cps7H基因的特异性引物，并通过优化引物浓度、退火温度等反应体系和条件，建立了cps7HPCR检测方法，并对该方法的敏感性、特异性等性能菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌2型及猪链球菌9bp2000250bp另外实验室从广州周边地区健康猪群及屠宰猪群采集的共计体样本中，共分离到猪链球菌222株，用建立的PCR方法鉴定bp2000750250通过分子杂交技术对比猪链球菌不同血清型菌株荚膜多糖合成相关基因簇公布的cps9H基因序列（JX986798.1设PCR检测方法，并对该方法的敏感性、特异性等性能进行了评估，可用于猪链bp2000250bp750500250另外实验室从广州周边地区健康猪群及屠宰猪群共计758中，分离到猪链球菌222株，用建立的PCR方法鉴定出猪链球bp2000250本方法以猪链球菌种属特异性基因recN作为靶基因，可用于猪链球菌所有Pathogens2016,5(3).编recN荧光PCR检测方法，并对该方法37(10).通过分子杂交技术对比猪链球菌不同血清型菌株荚膜多糖合成相关基火温度等反应体系和条件，建立了cps2J荧光PCR检测方法，并对该方法的参考文献（Smith,H.E.,etal.,RapidPCRtestforStreptococcussuisserotype7.型菌株荚膜多糖合成相关基因簇的基因序列，发现荚膜多糖合成相关基因簇的重复性好、操作便捷等优点，被广泛应用于动物疫病诊断与监测。本研究根据37(10).通过分子杂交技术对比猪链球菌不同血清型菌株荚膜多糖合成相关基参考马清霞等.猪链球菌病双重PCR诊断方法的建立[J].中国兽医科学,2007,37(8):700-704.；DB3中是高度保守的，而且在马链球菌兽疫亚种无gcagccctcttggttggtgtggcagctgtatcagcagattctgttgagtcagctaagcctgtagcagtttagatagtgaagccgcagctacaaaggcagaagctgatctagttgctgcaaaagcagacctagcagccaatcacagctgcaaaagctgaatttgacaccgctcaagcagacttagctaccgctgaagctactataaaaaatggctgagttagaaagcaaaattcaagaaaagcaaaaagagctagaggacatcattcgtaaaccatgcagctatcggtggtcgtaatggagacgctM、DL-2000Marker；1~13equiSubspecieszooepidemic列（CP002904.1设计了针对SzM基链球菌兽疫亚种ATCC35246株有特异性扩增曲构建的含SzM基因目的片段的阳性质粒，分光果显示标准品起始模板浓度与Ct值呈现具有良好2型等主要致病菌是一种非常重要的人兽共患病原菌，对猪链球菌病的有效控制本标准将提高了我国猪链球菌病诊断能力，预期培训国内外诊断技术人员10000余人次，提高猪链球菌病疫情研判效率，减少由猪链球菌病造成的生猪患上述标准中，主要涉及猪链球菌2型分离鉴定、血清抗体检测、PCR检测和节炎等为主要临床症状的猪传染性疾病，其主要病原是猪链球菌的某些血清型（主要为2、7和9型）和马链球菌兽疫亚二是部分内容填补了国内标准的空白。本标准增鉴定”中马链球菌兽疫亚种生化鉴定、“9猪链球菌通用PCR试验”、“11猪链球“15猪链球菌7型荧光PCR试验”、“16猪链球菌9型荧光PCR试验”、“17马链球“6猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的分离培养”中的猪链球菌分离培养、“7生化鉴定”中猪链球菌生化鉴定、“8猪链球菌链球菌2型PCR试验”、“14猪链球菌2型荧光PCR试验”等6部分虽与上述7项标准相似，但具有明显的先进性，以下就每项内容与国内标准“4.4.2分离培养”中使用的普通琼脂绵羊血平板，使猪链球菌的生长缓慢，培养周期长，本标准“6.3.2分离培养”中使用的THB绵羊血平板，可减少其本标准“6.3.2分离培养”中使用的THB绵羊血平板从血液、关节液、病料分离培化鉴定”中七叶苷发酵反应不稳定，假阳性率和假阴性率高，本标准“6.3.4猪链球菌生化鉴定”去除了七叶苷发酵反应，避免错误判定；国内标准“4.4.6猪链球菌2型定型PCR检测”仅能对2型进行PCR鉴定，本标准“9猪链球菌种特异性PCR规程》，本标准是对猪链球菌2型、7型和9型的菌株进行血清学检测，而不是对对比标准文件《GB/T19915.3－2005猪链球菌2型PCR定型检测技术》、率；标准《GB/T19915.4－2005猪链球菌2型三重PCR检测方法》将2型荚膜基因（cps2）、溶菌酶释放蛋白基因（mrp）和orf2三个毒力基因作为致病菌株的对比标准文件《GB/T19915.6－2005猪链球菌2型通用荧光PCR检测方法》方法》（GB/T19915.6-2005）和《猪链球菌2型荧光PCR检测方法》（GB/T19915.7-2005）建立过程中能够参考的猪链球菌的靶标基因序列为300而本标准参