GB∕T 34331-2017 黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜检测方法

黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜TestmethodofCucumbergreenmottlemosaicvirus2017-10-14发布2018-09-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局GB/T34331—2017 I Ⅱ 1 1 26透射电子显微镜检测步骤 47血清学和分子生物学验证 4 4 附录A(资料性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒相关资料 附录B(资料性附录)常用试剂的配方 附录C(资料性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒电镜照片 IⅡ124.2试剂和材料4.2.2四氧化锇(结晶体)。4.2.3丙酮(分析纯)4.2.8磷钨酸(分析纯)。4.2.9亚甲基蓝。超薄切片机：相对湿度小于60%,温度(20±5)℃,电源电压稳定(220±22)V,满足防震要求。透射电镜：相对湿度小于60%温度(20±5)℃,电源电压稳定(220±22)V,具备仪器专用地线，接5.1.3人工接种CGMMV的鉴别寄主和繁殖寄主植物。5.2.1进出境植物检疫的取样按照SN/T2122—2015的规定执行。5.2.2田间作物取样及试样处理按照SN/T2964—2011的规定执行。35.4.2.1在培养皿内铺上Para酸缓冲液(pH值7.2)配制的2%～3%(v/v)戊二醛固定液进行前固定，在4℃下固定2h。戊二醛固4铀染色时间15min～30min,柠檬酸铅染色时间5min～10min,干燥后待检。染色液的配制参见附录B。6.3推荐放大倍率范围：4000倍～20000倍。6.4悬液病毒试样的透射电镜观察：低倍率(4-000倍左右)下选择负染色剂着色的电子密度较大斑点用CCD相机记录并储存(或者用电子底片进行拍照)CGMMV粒子的典型形态参见附录C。6.5超薄切片试样的透射电镜观察，电镜低信率模式倍~1000倍)寻找切片，切换到正常放大模式观察病变的细胞。逐步提高放大倍率，仔细观察细胞超散或聚集分布在细胞质内，病毒聚集体中的病毒粒子呈整化。CGMMV感染的细胞图像精确聚焦后用CCD相机记录并储存(或者用电子底片进行拍照)。CGMMV粒子在感病细胞超薄切片中的典型形态参见附录C。8检测结果发布b)试样名称；f)检测结果和必要的说明；g)检测人签字；h)检测报告负责人的签字；i)检测报告的页码；j)发布检测报告的实验室名称和地址；5保存在4℃冰箱内，叶片和果实试样应保存在-20℃以下冰箱或冻干保存三67蛋白。5'端和3'端分别含有一段非编码区。A.7分类地位(摘译自：国际病毒分类委员会ICTV第九次病毒分类报告，2012)科(Family):植物杆状病毒科Virgaviridae属(Genus):烟草花叶病毒属Tobamovirus种(Species):曼陀罗木轻症斑驳病毒Brugmansiamildmottlevirus(BMMV)黄瓜果实斑驳花叶病毒Cucumberfruitmottlemosaicvirus(CFMMV)黄瓜绿斑驳花叶病毒Cucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV)鸡蛋花花叶病毒Frangipanimosaicvirus(FrMV)皮尔斯堡木槿潜隐病毒HibiscuslatentFortPiercevirus(HLFPV)新加坡木槿潜隐病毒HibiscuslatentSingaporevirus(HLSV)日本黄瓜绿斑驳花叶病毒Kyurigreenmotlemosaicvirus(KGMMV)老布达辣椒病毒Obudapeppervirus(ObPV)齿瓣兰环斑病毒Odontoglossumringspotvirus(ORSV)甜椒轻症斑驳病毒Paprikamildmottlevirus(PaMMV)辣椒轻症斑驳病毒Peppermildmotlevirus(PMMoV)长叶车前草花叶病毒Ribgrassmosai萨蒙氏仙人掌病毒Sanmon.Opuntiaarus(SOV)扭果苣营花碎色病毒Streptocarpusflowerbreakoirus(SFBV)烟草潜隐病毒Tobacolatentuirus(TLV)烟草轻症绿花叶病毒Pobadeomildgreenmosaictmrus(TMGMiv)烟草花叶病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)番茄花叶病毒Tomatomosaicuirus(ToMV)芜菁脉明病毒Turnipvein-clearingvirus(TVCV)块根落葵轻症斑驳病毒UllucusmildmottlevirusCUMMV)山嵛菜斑驳病毒Wasabimottlevirus(WMoV)油菜花叶病毒Youcaimosaicvirus(YoMV)小西葫芦绿斑驳花叶病毒Zucchinigreenmott8或NaH₂PO₄·2H₂O31.21gNa₂HPO₄·2H₂O或Na₂HPO₄·12H₂O4689取等量的0.2mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)与2%四氧化锇贮存液混合，现配现环氧树脂Spurr's低黏度包埋剂配制见表B.3。8888327B.3.2环氧树脂Epon812包埋剂环氧树脂Epon812包埋剂配制见表B.4。B.4染色液配方B.4.12%磷钨酸负染色液称取1.0g磷钨酸，用50mL双蒸馏水配制成2%(w/v)的水溶液，用1mol/LNaOH调6.7～6.8,过滤后4℃下保存备用。B.4.