苦苣菜总黄酮提取工艺的优化及鉴别

第八届“挑战杯”甘肃省大学生课外学术科技作品竞赛序号：编码：第八届“挑战杯”甘肃省大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书作品名称：苦苣菜总黄酮提取工艺的优化及鉴别学校全称：天水师范学院申报者姓名（集体名称）马静静类别：√自然科学类学术论文哲学社会科学类社会调查报告和学术论文科技发明制作A类科技发明制作B类

说明1．申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2．申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3．表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4．序号、编码由“竞赛组委会填写。5．学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。6．每个学校选送参加竞赛的作品总数不得超过30件，每人限报一件。研究生的作品不得超过作品总数的1/2，其中，博士研究生的作品不得超过3件。7．作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一报送。8．其他参赛事宜请向本届竞赛组织协调机构咨询。9．报送地址：第八届“挑战杯”甘肃省大学生课外学术科技作品竞赛组委会秘书处办公室（兰州大学团委）联系人：姚志海王永仁联系电话：（0931）52927638912914传真：（0931）8912684地址：兰州市天水南路222号兰州大学团委邮政编码：730000A1.申报者情况（个人项目）说明：1、必须由申报者本人按要求填写，申报者情况栏内必须填写个人作品的第一作者（承担申报作品60%以上的工作者）；2、本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况的确认。申报者情况姓名马静静性别女出生年月1987.8学校全称天水师范学院专业生物科学现学历本科年级四学制4年入学时间2007.9作品全称苦苣菜总黄酮提取工艺的优化及鉴别毕业论文题目红茂草的抑菌机理通讯地址甘肃省天水市天水师范学院57号信箱邮政编码741000联系电住地联系地址天水师范学院博闻公寓五单元202邮政编码741000单位电话合作者情况姓名性别年龄学历所在单位齐晓燕女22本科天水师范学院高健男22本科天水师范学院资格认定学校学籍管理部门意见是否为2011年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的各类高等院校中国籍学生（含专科生、本科生和研究生）。√是□否若是，其学号为：272010322（部门盖章）年月日指导教师意见（1-2名）本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果√是□否指导教师签名：年月日B1．申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1、必须由申报者本人填写；2、本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3、作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写。4、硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称作品分类（D）A、机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控制、工程、交通、建筑等）B、信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等）C、数理（包括数学、物理、地球与空间科学等）D、生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健康、卫生、食品等）E、能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路本文重点研究提取苦苣菜中总黄酮的最佳提取工艺,对芦丁提取材料的选择具有一定的指导意义。为开发和利用苦苣菜中有效成分提供理论依据。本文采用单因素和正交实验方法探讨乙醇提取法提取苦苣菜中总黄酮的最佳提取工艺,并且通过对黄酮类进行鉴别，得出芦丁的含量极高作品的科学性、先进性及独特之处采用科学的实验方法（如单因素控制变量，设立对照实验等）和严格的实验操作技术对所研究的问题进行了科学的实验，并对实验数据进行科学的处理，得出科学的实验结果。本文通过对HPLC流动相来测定苦苣菜中芦丁的含量,该法具有样品处理简单、分析周期短、重现性好等优点。作品的实际应用价值和现实意义通过研究苦苣菜中总黄酮的最佳提取工艺,为开发和利用苦苣菜中有效成分提供理论依据。通过研究苦苣菜中总黄酮的最佳提取工艺，并且对黄酮类进行鉴别，对芦丁提取材料的选择具有一定的指导意义。学术论文文摘通过单因素分析及正交试验探讨了提取苦苣菜中总黄酮的最佳条件，实验结果表明，总黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度为30%、料液比为1：20、提取温度为60℃、提取时间为1.5h，总黄酮的含量可达6.141mg/g，本实验操作简单，重现性好，平均回收率为97.94%，相对标准差为4.87%。通过对苦苣菜粉末中总黄酮的鉴别，得出芦丁的含量达到2.528mg/g作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表、所获奖励及鉴定结果无请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录1．JiaZ，ZhangPF，TaoBQ,etal.StudyonflavonesoftheflowerofJuglansregia[J].ChinPharmJ,2009,44(7):496-497.2．NissimGarti,KiyotakaSsto1Crystallizationandpolymorphismoffatsandfattyacids[M]1NewYork:MarcelDekkerINC,1988.3．周桂芬,张涵,吕圭源.苦苣菜中黄酮类化合物的含量测定[J]中华中医药学刊,2008，26(1)：218-220.4．郑和权,周守标．马兰总黄酮提取工艺优化及不同部位含量测定[J].安康学院学报，2009，34（11）：185-189．5．汤波,刘火安,贾云．竹叶总黄酮提取物的分离纯化方法的研究[J].时珍国医国药，2008，19（10）：2419-2420．6．苏健,王宝琴.银杏叶及其制剂中黄酮苷及内酯类活性成分含量测定方法研究进展[J].中国中医药信息杂志，2007,26（4）：189-202．申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）申报研究论文一篇科研管理部门签章年月日C．当前国内外同类课题研究水平概述说明：1、申报者可根据作品类别和情况填写；2、填写此栏有助于评审。黄酮类化合物是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物。黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，如槐米中的芦丁和陈皮中的陈皮苷，能降低血管的脆性，及改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血。由银杏叶制成的舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛的治疗。全合成的乙氧黄酮又名心脉舒通或立可定，有扩张冠状血管、增加冠脉流量的作用。许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌的活性。护肝，解肝毒、抗真菌、治疗急、慢性肝炎，肝硬化。Kim等首先报道银杏双黄酮可明显减轻小鼠关节炎症反应。早期研究发现基质金属蛋白酶9可直接降解骨与软骨,促进血管再生,与RA关节骨与软骨的破坏关系密切在关节软骨破坏中也起重要作用。从此黄酮类化合物开发应用才得到较大发展。近几年来，国内外学者对其进行了大量研究，刘利和潘一乐在2009年春秋桑“叶总黄酮含量分析及提取工艺优化”一文中采用分光光度法测定了不同品种春、秋桑叶总黄酮含量，在单因素试验基础上，通过正交试验，优化了桑叶总黄酮的提取工艺。康新平在2009年在“新疆锁阳中总黄酮的提取工艺优化及含量测定”一文中法以总黄酮含量为指标,以芦丁为对照品,用分光光度法比较了回流法、超声法、煎煮法从锁阳干燥肉质茎中提取黄酮类化合物的提取效率,采用正交表进行实验优化了超声法的提取工艺。郑和权和周守标在2009年“马兰总黄酮提取工艺优化及不同部位含量测定”一文中以马兰全株为材料运用超声波辅助法进行黄酮类化合物的提取,采用正交试验法分析比较乙醇体积分数、料液比例、水浴温度和提取时间对总黄酮提取量的影响。他们都运用不同的条件优化了总黄酮的提取方法，探讨了提取黄酮的最佳提取条件，使不同的物种中的总黄酮得到最大利用，为开发和利用总黄酮提供了较好的理论依据。应用范围：1在医学上的应用：1）黄酮类化合物可以治疗心脑血管系统的一些疾病，有降血脂、胆固醇的作用，还具有抑制血栓和扩张冠状动脉等作用，可用于治疗高血压、动脉硬化。由银杏叶制成的舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，用于冠心病、心绞痛的治疗。2）另外，黄酮类化合物能增强机体的非特异免疫功能和体液免疫功能，黄酮类化合物可以通过对巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）、LAK细胞、细胞因子以及影响胸腺来进行免疫调节作用。3）黄酮类化合物抗菌抗病毒作用已经得到医药界的肯定，这方面进行的研究较多，如银杏黄酮、槲皮素、桑色素、山奈酚、木樨草素和杨梅黄酮等均有抗病原微生物和抗病毒的作用。2黄酮类化合物在食品工业中的应用1）天然甜味剂甜度为蔗糖的950倍，而且此两种甜味剂回味无苦味，可直接用于各种食品，并具有保健作用。2）天然抗氧化剂研究表明，黄酮类化合物均具有较强的抗氧化能力。3）着色剂天然色素黄酮多呈黄色，同时又具有很宽的溶解性，既具有水溶性的黄酮类化合物，又有脂溶性的黄酮类化合物，所以完全可以根据食品加工的需要来选择合适的黄酮类化合物作为着色剂。萧伟祥等利用低档的绿茶或茶末制取了纯天然的茶黄色素和茶绿色素，并确定其中主要成分是黄酮类化合物。4）保健食品由于黄酮化合物具有多种保健功能，人们开发出各种保健食品。3在化妆品行业中的应用近几年黄酮类化合物已经得到很大的发展，目前国内还没有对苦苣菜中总黄酮提取工艺的研究报道，本文采用单因素和正交实验方法探讨乙醇提取法提取苦苣菜中总黄酮的最佳提取工艺，为开发和利用苦苣菜中有效成分提供理论依据。D．推荐者情况及对作品的说明说明：1、由推荐者本人填写；2、推荐者必须具有中级专业技术职称，其中一名必须具有高级以上专业技术职称，并是与申报作品相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组集体推荐亦可）；3、推荐者填写此部分，既视为同意推荐；4、推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓名王廷璞性别男年龄44职称教授工作单位天水师范学院生命科学与化学学院通讯地址甘肃省天水市莲亭路60号邮政编码741000单位电话0938－8367717移动电荐者所在单位签章（签章）年月日请对申报者申报情况的真实性作出阐述马静静同学所呈交的论文，是经过大量的文献积累，在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。论文数据真实可靠.请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价黄酮类化合物作为天然植物中的一种有效成分,来源广泛,药理作用明显，部分已进入临床使用,但提取工艺还需进一步研究探讨，本文通过对HPLC流动相来测定苦苣菜中芦丁的含量,该法具有样品处理简单、分析周期短、重现性好，内容真实，数据可靠，推荐参加大学生论文挑战杯竞赛。其它说明推荐者情况姓名赵菲佚性别男年龄38职称副教授工作单位天水师范学院生命科学与化学学院通讯地址甘肃省天水市莲亭路60号邮政编码741000单位电话0938－8367717移动电荐者所在单位签章（签章）年月日请对申报者申报情况的真实性作出阐述本论文所有数据均为申报学生在老师指导下完成，试验方法及过程参考已发表文献及国家相关标准，试验设有对照及重复，数据进行了统计分析,结果真实可靠。请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价本项目在参考已有的对苦苣菜总黄酮提取工艺的基础之上，对影响其产率的各种因素做了优化探讨，以乙醇浓度、温度、浸泡时间、料液比为考察因素，使用了正交设计方法，取得了对苦苣菜总黄酮提取的最优因素组合。在该优化条件下有着样品前处理简单、提取时间短、产物成分稳定的特点。本项目的完成对苦苣菜总黄酮的工业提取工艺具有一定的指导作用，有着较大的实际应用价值。其它说明学校组织协调机构确认并盖章（团委代章）年月日校主管领导或校主管部门确认盖章（盖章）年月日E．组织委员会秘书处资格和形式审查意见组委会秘书处资格审查意见审查人（签名）年月日组委会秘书处形式审查意见审查人（签名）年月日组委会秘书处审查结果□合格□不合格负责人（签名）年月日F.作品打印处苦苣菜总黄酮提取工艺的优化及鉴别马静静高健齐晓艳指导老师:王廷璞赵菲佚（天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741000）【摘要】通过单因素分析及正交试验探讨了提取苦苣菜中总黄酮的最佳条件，实验结果表明：总黄酮的最佳提取条件为，乙醇浓度为30%、料液比为1：20、提取温度为60℃、提取时间为1.5h，总黄酮的含量可达6.141mg/g，本实验操作简单，重现性好，平均回收率为97.94%，相对标准差为4.87%。通过对苦苣菜粉末中总黄酮的鉴别，得出芦丁的含量达到2.528mg/g。【关键词】：苦苣菜;总黄酮;提取工艺;优化;鉴别TheIdentiticationandoptimizationofprocessforextractingtotalflavonoidsinConchesOleraceusLMaJingJingQiXiaoYanGaoJianSupervisor:WangTingpuZhaoFeiyi(DepartmentofLifeScienceandchemistryofTianshuiNormalUniversity,Tianshui，Gansu741000)Abstrac:Inthispaper,theoptimalparametersforextractingtotalflavonoidsinConchesOleaeusLwereassaiedusingorthogonalexperimentaldesignofsignalfactor.Theresultsshowedthattheoptimalparametterswerecombinationof30%ethanolconcentration,1:10rationofsolidtoliquidand60℃temperatureofimergeextractfor1.5h.Theyieldoftotalfoavonoidswereupto6.141mg/gemployedthismethod.Moreover,thecontentofRutinintotalextractswerepresentedat2.528mg/g.Forthequalitycontrolofassay,thefidelityfactorandRSDwere97.94%and4.87%,respctively.Together,thisnovelassayissimpleandreproducibleandshoeweditspotentialapplicationsinindustry.keywords:SonchusOleraceusTotalflavonoidsExtractiontechnologyOptimizationIdentification苦苣菜(SonchusoleraceusL1)系菊科(Composite)苦苣属(Sonchus)1～2年生的草本植物。味苦,性寒[1]。具有清热解毒,凉血止血等作用。主治肠炎、痢疾、黄疸、咽喉肿痛、吐血、尿血等症[2]苦苣菜的水提液对动物耐缺氧和急性心肌缺血具有明显的保护作用[3]。苦苣菜总黄酮对实验性肝损伤具有明显的保护作用,苦苣菜酸性提取物具有抗肿瘤作用[4]民间常将其用于治疗黄疸性肝炎,而且资源丰富,有重要的开发利用价值。近年来，苦苣菜这一资源已受到广泛的重视,被制成消暑保健食品、罐头等,畅销国内外，并跻身于美国市场上最畅销的“十大天然药用植物”之一[5]，具有广泛的发展前景。黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物，具有增强心血管功能、抗肿瘤、增强免疫力、延缓衰老等作用[4，5],黄酮类化合物还具有降血脂、止血、抑制血小板聚集等多种药理作用。因而广泛用于医药、食品等行业,具有极广的开发应用前景。因此对苦苣菜中的总黄酮进行测定、提取有一定的意义。目前国内还没有对苦苣菜中总黄酮提取工艺的研究报道，本文采用单因素和正交实验方法探讨乙醇提取法提取苦苣菜中总黄酮的最佳提取工艺，为开发和利用苦苣菜中有效成分提供理论依据。以前芦丁的测定方法报道中多利用其显色反应用比色法测定[6]，但存在操作繁,易受干扰及显色体系不够稳定的缺点。本文通过对HPLC流动相[7]：甲醇：水：乙酸=42:57:1。流速：1ml/min;检测波长：368nm;样品进样量：20ul。来测定苦苣菜中芦丁的含量，该法具有样品处理简单、分析周期短、重现性好等优点,而且苦苣菜中含量达2.528mg/g。1材料与方法1．1材料1.1.1实验材料:苦苣菜在2009年2月10日1.1.2试剂:芦丁标准品（南京替斯艾么生化试剂厂出品）；无水乙醇；硝酸亚硝酸盐（AR）；氢氧化钠（AR）；三氧化铝(AR)；色谱纯甲醇1.1.3仪器:756紫外-可见光分光光度计(上海第三分析仪器厂)；Biofuge台式高速离心机；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)；电热恒温水浴锅(北京泰克仪器有限公司)；岛津分析天平（岛津制作所）；DS-1高速组织捣碎机（上海精科实业有限公司）；Agilent-1100型液相色谱仪（美国安捷伦公司制造）1.2．方法1.2.1标准曲线的建立[8]精确称取芦丁对照品10mg，置于25ml容量瓶中，用30%的乙醇在60℃恒温水浴溶解并定容，精确吸取0.0ml；0.2ml；0.4ml；0.6ml；0.8ml；1.0ml置于容量瓶中，加50%NaNO2溶液0.3ml，放置50min，再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3ml，放置5min，加4%NAOH溶液4.0ml，加水至刻度，摇匀，放置30min，分别再510nm处测定不同浓度下的吸收值作标准曲线，得到芦丁浓度与吸光度A关系曲线如下:C=6.430A+0.012R=0.998如图所示：(实验数据见附表表（1）图1直线回归方程曲线图Fig.1Thecurveoflinearregressionequation12.2苦苣菜总黄酮的制备和含量测定[9]准确称取1.0g研细的苦苣菜末，加30ml30%乙醇，60℃下浸泡1h，趁热抽滤，滤渣再加入20ml溶剂；浸泡0.5h，抽滤，合并滤液。3500r/min离心20min，然后取滤液用乙醇定容到50ml备用，测定其含量[10]（方法同标准曲线相同的方法测定）,计算提取率e（实验数据见附表表（2（Y黄酮类物质的质量浓度mg/ml；V原提取液体积；W苦苣菜用量a稀释倍数）根据所测定溶液的吸光度，用曲线方程计算出Y。 1.2.3回收实验[11]取已知含量的苦苣菜供试样品溶液6份,每份分别加入一定量芦丁对照品溶液,按供试样品溶液的制备方法进行含量测定，回收率为97.98%，结果表明该方法加样回收率良好。（实验数据见附表表3）*100%1.2.4重现率试验取苦苣菜粉末1g。按前述方法提取后加入标准芦丁对照品2ml，同前样品测定方法操作按标准曲线的方法测定吸光度，求出总黄酮含量，结果表明本实验结果的重现率高，RSD=4.87%,试验方法可靠。（实验数据见附表表4）1.2.5乙醇提取法的单因素及正交试验设计通过对乙醇提取法提取工艺中乙醇浓度、料液比、提取温度，提取时间等影响苦苣菜中总黄酮提取量的因素进行单因素及正交实验,确定最佳的工艺参数。表1正交试验因素及水平表Table1Factorsandlevelsoforthogonalexperiment水平StandardA乙醇浓度EthanolConcentrationB温度TemperatureC时间TimeD料液比Solid-liquidratio115%601h1：10230%701.5h1：20345%802h1：301.2.6定性实验------总黄酮的鉴别(1)颜色反应1)浓氨水反应：取样品溶液点在滤纸上，将滤纸在浓氨水上方熏0.5min，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。2)乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加10%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点3)HCL-Mg反应：取乙醇提取液1ml于试管中加Mg，在加入浓盐酸数滴，1～2min内微热即可显示紫红色。(2)纸层析取样品溶液10ml点在滤纸上，用正丁醇：醋酸：水=4：1：5为展开剂，上行展开5h，取出晾干，喷10%氯化铝乙醇，吹干后紫外光下，可见荧光斑点，其中A,B,C为实验组，O为对照组。X为未知斑点，用浓氨水显色处理。(3)苦苣菜中黄酮类（芦丁）的高效液相色谱测定1)配制样品溶液：提取的苦苣菜总黄酮，加30%的乙醇定容到100ml，用孔径为45um的微孔滤膜过滤的HPLC样品液。2)配制对照品溶液：称10mg芦丁标准对照品，用30%的乙醇定容到50ml对照液。3)选择色谱条件：色谱柱C18(4.6mm*200mm*5um)；柱温：室温；流动相：甲醇：水：乙酸=42:57：1；流速：1ml/min；检测波长：368nm样品进样量：20ul。4)配制线性关系：取标准品5mg溶于12.5ml30%的乙醇中，得第一个标准品应用液0.4mg/ml。再依次稀释两倍，依次配制5个对照品应用液。在色谱条件下进样2ul2次，求出平均峰面积。5)精密度试验以标准曲线中间浓度0.100mg/ml(2.0μg/20μl)为样品,在色谱条件下重复进样6次，分析测定芦丁的含量，记录保留时间,进行统计分析,结果表明,保留时间与芦丁含量的RSD均在5%以下，表明本实验条件具有良好的重现性,色谱条件合理。6)重复性试验分别五次吸取苦苣菜总黄酮类样品，每次进样20ul，打印高效液相色谱图谱，统样品峰高，列表计算相对标准方差（RSD）分析实验可重复型，结果如表（5）本实验结果的重现性高，RSD=2.286%，试验方法可靠。2结果与分析2.1.单因素试验2.1.1乙醇浓度对提取的影响准确称取6份（1.00g）苦苣菜粉末，分别用15%，30%，45%，60%，75%，90%的乙醇溶液，以1:50的料液比，浸泡相同量的样品1.5小时。过滤，定容到50ml，测定其吸光度A值,结果如图(1)所示（实验数据见附表表（5））图2乙醇浓度对提取的影响Fig.2Effectofethanolconcentrationonextraction从图标可得知：随着乙醇浓度的提高，黄酮类物质的提取量增加（15%-30%），当乙醇浓度是30%时，黄酮得率最高。在实验中发现随着乙醇浓度的增加，黄酮类化合物溶解度减小，同时一些醇溶性杂质，色素，亲脂性的成分溶出量增加，这些化合物竞争同乙醇，水分子结合，从而导致黄酮得率下降，并且不利于黄酮类物质的进一步提纯[13，14]。因此选30%的乙醇浓度浸泡最为合适。2.1.2准确称取6份（0.10g）苦苣菜粉末，用30%的乙醇溶液，以1:50的料液比，分别浸泡0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h,过滤，定容到50ml，测定其吸光度A值。结果如图（2）所示（实验数据见附表表（6））图3提取时间对浸泡的影响Fig.3Effectofextractiontimeonconcentration从图表可以得出随着浸泡时间的延长，黄酮得率增加，当浸泡时间是1.5h时，黄酮得率达最大，延长浸泡时间，黄酮得率下降，但随着提取时间的继续延长,总黄酮含量反而降低,可能是由于提取时间太长,有部分乙醇挥发而导致沸点逐渐增大,从而破坏某些黄酮类化合物[15]。故从提取工艺的角度来看，我们选择1.5h左右作为考虑对象。2.1.3料液比对提取的影响准确称取6份（1.00g）苦苣菜粉末，分别以料液比（1：10，1：20，1：30，1：40，1：50，1：60）以30%的乙醇提取，提取时间1.5h，测定其吸光度A，结果如图所示：（实验数据见附表表7）图4料液比对提取的影响Fig.4Effectofsolid-liquidratioonextraction从图表可以得出随着料液比的增加，黄酮得率下降，当料液比为1：30以上时，增加料液比，黄酮得率略有下降，考虑到生产成本，料液比以1：10为佳。2.1.4浸提温度对提取的影响准确称取6份（0.10g）苦苣菜粉末，回流温度分别为30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃,以1：10的料液比浸泡1.5h,趁热过滤，滤液稀释5倍，测定其吸光度A值。结果如图所示（实验数据见附表表8）图左侧的字看不清。要在原图上修改图左侧的字看不清。要在原图上修改图5浸提温度对提取的影响Fig.5Effectoftemperatureonextraction从图表可以得出随着温度升高，黄酮得率也在升高，60℃达到最高可能是过高高温有利于黄酮物质的溶出，而且过高的温度会造成一些不稳定黄酮类化合物的分解，故选择60℃左右为宜。2.2提取方法的正交设计方案，得出结果（生物统计）（四因素水平）在试验中，由于各因素之间相互交叉影响，因此为全面考虑乙醇提取法的工艺参数,根据单因素试验的结果,确定以乙醇浓度、回流时间、回流温度、料液比四种因素进行正交试验设计[17]，以测定苦苣菜样品中的总黄酮的含量。试验设计及结果见下（实验数据见附表表9）表2正交试验设计结果Table2Designoforthographicexperiment试验水平总黄酮（mg/g）TestLevelsTotalflavonoidsABCD1156011:102.569215701.51:202.213158021:305.114430601.51:305.1075307021:101.9786308011:206.1417456021:204.6088457011:302.335945801.51:101.524T13.2983.4283.6822.024T24.062.1742.9474.32T32.8224.263.94.185R值1.2382.0860.9532.296以上单因素试验的基础上，确定提取次数为三次，对影响苦苣菜中总黄酮的提取效果因素上进行L9(34)正交试验，并对试验结果进行统计分析，结果如上表，从极差的分析结果来看，影响苦苣菜中总黄酮提取效率的因素主次顺序是：D>B>A>C,最佳组合A2B3C1D2,即乙醇浓度为30%，温度为80℃，提取时间为1h,料液比为1：20。因为最佳组合不在试验设计中，需做验证实验。2.3验证试验按上面优化工艺A2B3C1D2平行提取三次，平均得率为6.065mg/g,表综上所述得出提取苦苣菜总黄酮的最佳提取工艺，既乙醇浓度为30%，提取温度为80℃，提取时间为1h,料液比为1：20。2.4定性检测结果对苦苣菜中提取样品分别进行显色、还原、络合反应表3黄酮类化合物的定性鉴定项目Item反应类型显色反应还原反应络合反应（colorreaction）(reductionreaction)(complexreaction)试剂浓氨水Hcl-MgMg(Ac)2现象黄褐色紫红色黄绿色由以上特征可以判断样品中可能含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇类化合物。Table(3)Qualitativeidentificationoflavonoidscompound2.5纸层析的定性分析图6纸层析图谱Fig6Thefingerprintoffilter-paperchromatography结果分析;粗黄酮的纸层析结果表明，苦苣菜黄酮纸层析展开的主要斑点a和b的Rf值与芦丁标准品相同(Fro=0.57),说明在该黄酮中,主要成分是芦丁,图中另有一微小斑点X与氨水显色呈棕黄色,属黄酮或酚类物质,具体成分尚待确定。A、B、C三种粗黄酮点样并展开,A、B两样品均无拖尾现象,而样品C严重拖尾,说明其中杂质过多。2.6苦苣菜中黄酮类（芦丁）的高效液相色谱测定结果分析：以芦丁标准品对峰面积作回归曲线，得回归方程y=21264x+81.64，R2=0.993图7回归方程曲线图Fig7Thecurveoflinearregressionequation在色谱条件测样品中芦丁的含量,含量为苦苣菜中总黄酮的55.44%,即2.525mg/g高效液相色谱芦丁标准品图谱TheHPLCspectrogramofrutinstandard样品高效液相色谱谱图TheHPLCspectrogramofrutinsample结果分析测得样品的峰面积是1260.58521，代入回归方程得样品中含芦丁为0.055mg/ml，芦丁标准品的含量为0.1mg/ml。则苦苣菜中总黄酮含芦丁为55.44%，含量丰富，是提取芦丁的优良材料，并且分布广泛，取材方便，便宜实惠。图谱中出现的tR，显著性差异不大，色谱分离的芦丁标准品峰形对称,并与相邻杂质峰能够达到基线分离，定量值准确，值得探讨及加深研究，并加以应用。2.7精密度试验表4精密度试验Table4Theassayofprecision试验号(TestNo)标准品峰高(Standardpeakheight)1134.872138.953137.744140.535138.36平均值（X1）(mean)138.092X-X1-3.1240.861-0.3512.4390.271标准差（S）(Standarddeviation)0.248相对标准差(RSD,%)(Relativestandarddeviation)2.0762.8重复型试验表5重复型试验Table5Theassayofrepetition试验号12345样品峰高(Standardpeakheight)95．39995.95297.964102.57101.34平均值（X1）(Mean)98.645X-X1-3.245-2.693-0.6813.2932.696标准差（S）(Standarddeviation)0.239相对标准差(Relativestandarddeviation)(RSD,%)2.2863小结(1)详细研究了苦苣菜总黄酮类化合物的提取工艺，为开发利用该资源提供有益的参考。(2)通过单因素分析及正交实验结果表明:苦苣菜中含有丰富的黄酮类化合物,在乙醇热浸提提苦苣菜中的黄酮类化合物时，乙醇浓度是影响黄酮类化合物提取率的关键因素，影响苦苣菜中黄酮类物质提取量的因素主次顺序为:乙醇浓度>提取温度>提取时间>料液比。测定了苦苣菜中总黄酮的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度30%,提取温度60℃,料液比为1:20，提取时间为1.0h。在最佳的提取工艺条件下测得苦苣菜中总黄酮含量6.141mg/g(3)通过对HPLC流动相：甲醇：水：乙酸=42:57;1.流速：1ml/min.检测波长：368nm样品进样量：20ul.来测定苦苣菜中芦丁,该法具有样品处理简单、分析周期短、重现性好等优点，而且苦苣菜中含量达2.258mg/g,证明苦苣菜是提取芦丁的最优材料。4讨论4.1正交实验结果表明:苦苣菜中含有丰富的黄酮类化合物，在乙醇热浸提提苦苣菜中的黄酮类化合物时,乙醇浓度是影响黄酮类化合物提取率的关键因素,影响苦苣菜中黄酮类物质提取量的因素主次顺序为:乙醇浓度>提取温度>提取时间>料液比。测定了苦苣菜中总黄酮的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度30%,提取温度60℃,料液比为1∶20，回流时间为1.0h。在最佳的提取工艺条件下测得苦苣菜中总黄酮含量达6.141mg/g4.2黄酮类化合物是存在于自然界的一大类化合物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。由于黄酮化合物具有消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能,能起到抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老等作用[17，18],日益受到人们广泛关注，对黄酮类化合物的研究也日益增多，由于植物药以其天然低毒[19]的特点倍受青睐，因此,从植物中寻找新的黄酮药源成为人们研究的热点。实验结果表明苦苣菜中含有丰富的黄酮类化合物，具有广泛的开发前景和利用价值[20]，值得综合利用和加强资源开发。4.3以前芦丁的测定的方法报道中多利用其显色反应用比色法测定[21]，但存在操作繁琐，易受干扰及显色体系不够稳定的缺点。本文通过对HPLC流动相：甲醇：水：乙酸=42:57:1；流速：1ml/min；检测波长：368nm；样品进样量：20ul；来测定苦苣菜中芦丁[22],该法具有样品处理简单、分析周期短、重现性好等优点,而且苦苣菜中含量达2528mg/g，甘肃苦苣菜资源丰富，实惠便宜，利用方便，值得进一步研究，并加以推广应用。4.4在黄酮类化合物中，芦丁具有主要的药用价值，它具有抗炎作用[23]；维生素P样作用，具有维持血管抵抗力、降低其通透性、减少脆性等作用，对脂肪浸润的肝有祛脂作用，与谷胱甘肽合用祛脂效果更明显；抗病毒作用和抑制醛糖还原酶作用。据实验报道[24]，冬枣，银杏，苦丁茶，芦笋等物质中含有芦丁，相比之下，苦苣菜资源分布广，采集容易，而且可以大量人工种植，适应性强[25],,容易推广，是一种提取芦丁的最佳材料。4.5本文对苦苣菜中总黄酮的含量及黄酮中的芦丁的含量进行了研究及鉴别[26]。虽然目前没有报道黄酮中各类黄酮类物质进行分离及鉴别，但本文提出了黄酮的药理活性，将进一步做抑菌实验证明。而且也将对不同地区苦苣菜中总黄酮含量做出比较，来探讨分子水平上对编码黄酮的基因进行定位分析，从群体水平上进行遗传分析及其对基因的分离、纯化及克隆。因此为了推广苦苣菜提取总黄酮类物质及提取芦丁将进行下一步实验。参考文献[1]伍伟超,翟延君,李正言．正交试验优选柘木总黄酮提取工艺研究[J]．中华中医药学刊,2010,28(2):352-354.[2]江苏新医学院．中药大辞典·上册[M]．上海:上海科学技术出版社,1986:1286.[3]王晓静,贾献慧,孙敏耀等．猪毛菜总黄酮的提取工艺研究[J]．上海中医药杂志,2010,44(1):73-74.[4]MercaderAG,DuchowiczPR,FernándezFM,etal.QSARpredictionofinhibitionofaldosereductaseforflavonoids[J].Bioorganic&MedicinalChemistry,2008,(16):7470-7476．[5]王秋红,刘畅,方波．花生壳黄酮微波碱法提取工艺研究[J].食品科技,2010,35（1）：207-209．[6]LaiHF,LinCW,ChenHY,etal.Microwaveassistedextractionoftheantioxidantcompo2nentsfromEuonymufortunei(Turcz)Hand2Mazzoptimizedbytheresponsesurfacemethod.FineChemIndus,2008,25:8692871.[7]马彦梅,李炳奇,廉宜君．棉花根茎叶中黄酮类化合物的超声提取及含量测定[J]．时珍国医国药,2008,19（9）:2254-2256．[8]康新平．新疆锁阳中总黄酮的提取工艺优化及含量测定[J]．时珍国医国药,2009,21（1）：105-106．[9]MauricioJ,AlmeidaD,NegriG,etal.Antiproliferativeandantioxidantactivitiesofatricinacylatedglycosidefromsugarcane(Saccharumofficinarum)juice[J].Phytochemistry,2007,68:1165-1171．[10]汤波,刘火安,贾云．竹叶总黄酮提取物的分离纯化方法的研究[J].时珍国医国药,2008,9（10）：2419-2420．[11]李胜华,伍贤进,刘惠君．超声波提取翻白草中总黄酮优化工艺研究[J].食品科技,2008,1:167-170.[12]周桂芬,张涵,吕圭源.苦苣菜中黄酮类化合物的含量测定[J]．中华中医药学刊,2008,26(1)：218-220.[13]刘永静,陈丹,黄庆德.玳玳果中总黄酮研究提取工艺[J].中国医院药学杂志,2009,29(21):1826-1821.[14]王晓静,贾献慧,孙敏耀等.猪毛菜总黄酮的提取工艺研究[J].上海中医药杂志,2010,44(1):73-74.[15]LeeHS,KimJG1Effectsofdebitteringonredgrapefruitjuicecontentrate[J]1FoodChemistry,2003,82(2):177-1801.[16]NissimGarti,KiyotakaSsto1Crystallizationandpolymorphismoffatsandfattyacids[M]1NewYork:MarcelDekkerINC,1988.[17]邢福国,刘阳.花生粕总黄酮的提取工艺[J].食品研究与开发,2010,31(1):17-20.[18]苏雅静,孙爱东,高雪娟.竹笋壳总黄酮提取工艺的响应面设计优化[J].食品工业科学,2010,6（4）：189-202,[19]朱慧,马瑞君．三裂蟛蜞菊茎总黄酮含量的提取及其抗氧化性研究[J]．食品科学,2009,30（6）：52-56．[20]DengXQ,GongSZ.Researchprogressonmicrowave2assistedextractionofeffectiveconstituentsfromChineseherbalmedicine.GuangdongChemIndus,2006,33:89292.[21]李姣娟,黄克瀛,龚建良等．川桂叶中黄酮类化合物的提取与测定[J].光谱实验室,2009,26（3）：531-534．[22]毛琼玲,艾来提．新疆菊苣籽中总黄酮提取工艺研究[J].生物技术,2009,19(3):78-80．[23]郭明,杨群超,朱灵芝等．荷花不同部位总黄酮分布及荷叶黄酮提取工艺研究[J].中国现代应用药学杂志，2009,26(3):211-215．[24]黄灿,王斌,贺建云．熟地总黄酮的含量测定及其超声提取工艺优化[J].化学与生物工程，2009,26(4):70-71．[25]KalilSJ,MaugeriF,RodriguesMI.Responsesurfaceanalysisandsimulationasatoolforbioprocessdesignandoptimiza2tion.ProcessBiochemistry,2000,35:5392550.[26]潘兰英,袁弘,王芳等．菊花缓释片制备工艺与处方优化[J]．中国药学杂志,2010,45(2):124-127．附表表（1）芦丁的标准曲线的绘制Table(1)Thestandardcurvedrawingofrutin12345 630%乙醇c0.00.20.40.60.810NaNO20.30.30.30.30.30.3AL(NO3)30.30.30.30.30.30.3NaOH4.04.04.04.04.04.0蒸馏水5.45.25.04.84.64.4A0.0000.0700.1500.2290.2810.3080.0000.0720.1530.2280.2810.3100.0000.0720.1520.2280.2810.309表（2）苦苣菜总黄酮的含量测定表Table(2)DeterminationoftotalflavonoidsinSonchusA值0.1500.1520.154C值0.9958总黄酮含量(mg/g)4.979表（3）回收实验数据表Table(3)ThedataSheetofRecoveryExperiment编号加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)10.100.504198.6620.100.509695.6930.150.606797.2440.150.611499.1197.9850.200.707897.9960.200.709399.21表（4）重现率试验数据表Table(4)ThedatasheetofReproduceTest试验号12345总黄酮含量（mg