血液细胞组织化学幻灯片

关于血液细胞组织化学幻灯片概述

细胞化学染色是在组织化学的基础上发展起来的一个学科分支，是细胞学与化学相结合而形成的一门科学，研究细胞的化学成分，在保存血液细胞形态的基础上，在细胞原位显示化学反应的结果，根据化学反应的原理，研究细胞成分的化学性质。

第2页,共65页，星期六，2024年，5月研究目的及临床应用

研究正常血液细胞的活动与生理功能提高血液病的诊断和鉴别诊断水平

确定急性白血病的类型

有助于某些血液病的鉴别诊断观察疗效和估计预后

探索某些血液病的发病原理及治疗机制

第3页,共65页，星期六，2024年，5月标本的选择

BM片、血片、淋巴结印片、脾印片等均可作组化染色。用于酶染色的标本应尽可能新鲜。用于非酶染色的标本可在室温下放置1个月，如PAS标本。

第4页,共65页，星期六，2024年，5月固定的目的及方法

目的保持细胞生前的结构与化学成分，并使血膜在染色、冲洗过程中不易脱落损坏。常用化学固定方法

甲醛蒸汽固定：将滤纸平铺于染色缸底部，加入少许40%甲醛溶液。将涂片标本放入缸内，加盖使甲醛蒸汽固定血膜5-10分钟，水洗后晾干。液体固定：常用的固定液为乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等，也可用两种或两种以上成分组成混合固定液。

第5页,共65页，星期六，2024年，5月显示方法

纯化学方法

金属沉淀法

偶氮偶联法

联苯胺色素法

Schiff反应

普鲁士蓝反应类化学方法

物理学方法第6页,共65页，星期六，2024年，5月复染方法

复染是细胞内化学成分显色后，为了便于观察而进行的对比染色方法。

细胞核复染法：常用染料为苏木精、甲基绿、核固红、沙黄等。

细胞浆复染法：常用染料为伊红、光绿等第7页,共65页，星期六，2024年，5月过氧化物酶染色（Peroxidasestain,POX）第8页,共65页，星期六，2024年，5月目的急性白血病的鉴别诊断

AML：阳性

ALL：阴性第9页,共65页，星期六，2024年，5月分布特点-1原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。中性粒细胞：自早幼粒细胞起随细胞成熟阳性强度递增。阳性颗粒圆形，规则，直径与嗜苏丹黑颗粒相仿，比瑞氏染色特殊颗粒大。嗜酸粒细胞：阳性反应，颗粒比中性粒细胞的大，着色深。嗜碱粒细胞：阴性反应，在CML时可出现阳性反应。第10页,共65页，星期六，2024年，5月分布特点-2在粒细胞系统中，过氧化物酶颗粒的出现和增多与特殊颗粒的出现和增多有平行关系。单核细胞系：原单呈阴性反应，幼单和单核细胞呈弱阳性反应。阳性颗粒少而细小，弥散分布，有的也可呈阴性反应。其他细胞：淋巴细胞、巨核细胞、血小板、幼红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。有的吞噬细胞可呈阳性反应第11页,共65页，星期六，2024年，5月第12页,共65页，星期六，2024年，5月试剂配制0.3%联苯胺酒精溶液：

联苯胺0.3g+95%乙醇全溶后，加入亚硝基铁氰化钠饱和水溶液1ml。可保存1-2年。

过氧化氢溶液配制：

3%过氧化氢1滴+蒸馏水5ml，须每次用时新鲜配制。

第13页,共65页，星期六，2024年，5月染色步骤于新鲜涂片上滴加复方联苯胺染液3－8滴，使涂片盖满。1－2分钟后加入等量过氧化氢溶液。4－8分钟后用水冲洗，空气中晾干。用瑞氏染液复染，凉干后油镜观察。第14页,共65页，星期六，2024年，5月染色原理

粒细胞及部分单核细胞胞浆内的颗粒中含有过氧化物酶，该酶能分解过氧化氢，释放出新生态的氧。从而使无色的联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝。联苯胺蓝是一种不稳定的中间产物，它可进一步氧化变成棕色的化合物

第15页,共65页，星期六，2024年，5月结果判断阳性反应为蓝色或蓝棕色颗粒，定位于胞浆中。第16页,共65页，星期六，2024年，5月临床意义ALL时，原始细胞的POX阳性小于3%。AML时，原始细胞的阳性≥3%。在多数的M1、绝大部分M2和M3中，原始细胞的阳性率大于85%。M4和M5时，原单有时可呈弱阳性，但绝大多数的原单是POX阴性。M6，原粒和幼稚粒细胞是POX阳性，幼红细胞是POX阴性。在M7，血小板POX的活性只能在超微结构上证实。MDS时，粒细胞白血病和感染所致的WBC增高时，成熟中性粒细胞的POX活性可能降低或消失。CML时，成熟中性粒细胞的POX活性增强。第17页,共65页，星期六，2024年，5月

注意事项

已固定的血膜因为酶已破坏不能再作过氧化物酶染色。所用过氧化氢必须新鲜，加于血膜上应能发生泡沫。过量时红细胞可出现假阳性。过氧化氢的浓度要适当加减，过量则颗粒色深，不足则颗粒色淡。滴加过氧化氢液之后，最好将染片置于载物台上，用低倍镜观察，发现胞浆出现阳性颗粒时，立即水洗。第18页,共65页，星期六，2024年，5月第19页,共65页，星期六，2024年，5月

糖原染色

（Periodicacid-Schiffreaction,PAS）第20页,共65页，星期六，2024年，5月目的

红白血病（++++）与巨幼红细胞贫血（-）的鉴别诊断MDS与巨幼红细胞贫血（-）的鉴别诊断单核细胞白血病（+）与组织细胞病（MH）的鉴别诊断淋巴肉瘤、何杰金病与急性淋巴细胞白血病的鉴别诊断高歇病与尼曼-匹克病的鉴别诊断

以上都是前者增高，后者降低或阴性。

第21页,共65页，星期六，2024年，5月试剂

-110g/L过碘酸液Schiff染液：碱性品红0.5gDH2O100mlDH2O煮沸后待片刻，加入碱性品红，振荡数分钟使品红溶解，冷至50℃加入1M的盐酸20ml，混匀。待冷却至25℃加入偏重亚硫酸钠0.5g，混合，置于带塞的棕色瓶中，放于暗处24小时。染液为无色，如为微红则加活性炭1－2g，混合过滤，如过滤液仍有红色，应再加少许活性炭，至红色完全被吸收为止。制成后置于棕色瓶内保存在冰箱备用，如变为红色，则不能使用。

第22页,共65页，星期六，2024年，5月试剂-2

苏木素液：苏木素0.9g95％乙醇10ml

铵（钾）明矾20gDH2O200ml

将苏木素溶于95％的乙醇，钾明矾溶于水（可加热），然后将苏木素液加入明矾液中混合，用强火煮沸后加氧化汞0.5g，迅速搅拌，呈深紫色，迅速移入冷水中，次日过滤，临用时取此液95ml加冰醋酸5ml，可使细胞着色清楚。

第23页,共65页，星期六，2024年，5月染色步骤

将新鲜血片或骨髓片用95％乙醇固定10分钟。10g/L过碘酸液作用20分钟DH2O洗涤1分钟，晾干Schiff染液，60分钟用自来水洗涤15分钟（细水长流冲洗）苏木素染液10分钟。自来水冲洗15分钟，待干镜检。

第24页,共65页，星期六，2024年，5月染色原理

过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合，呈红色，定位于胞浆上。

第25页,共65页，星期六，2024年，5月结果判断

正常BM：有核红细胞几乎均呈阴性反应，在AML－M6，幼红细胞为PAS强阳性。中性粒细胞：原粒细胞多为阴性，早幼粒阶段开始呈PAS阳性，其后各阶段阳性逐渐增强。巨核细胞和血小板：不含糖原，但含粘多糖等，故巨核细胞为细小弥散的阳性，PLT为粉红色。ALL：可以是密集粗块状的颗粒，也能是细小弥散的颗粒，或是这两种颗粒的混合。ALL的PAS也可能为阴性，特别是L3时。单核细胞白血病，原单细胞常为阴性，幼单和成熟单可有弱阳性或弥散阳性。

第26页,共65页，星期六，2024年，5月注意事项

1）

Schiff液变红不能再用。2）

碱性品红的质量很重要，如碱性品红不合格，加活性炭，颜色也不被吸附。如无苏木精复染液，可用1%甲绿复染25分替代。

第27页,共65页，星期六，2024年，5月第28页,共65页，星期六，2024年，5月第29页,共65页，星期六，2024年，5月第30页,共65页，星期六，2024年，5月非特异性酯酶染色第31页,共65页，星期六，2024年，5月原理

非特异性酯酶是作用于短链脂肪的酶，当酯酶活性存在时，水解基质中的α－醋酸萘酚，与重氮盐偶联，生成不溶性的有机产物，定位于胞浆上。第32页,共65页，星期六，2024年，5月试剂甲醛：基质液：

1/15M的磷酸缓冲液PH7.440ml10g/Lα－醋酸萘酚50％丙酮液0.8ml重氮盐（DiazoblueB）40mg第33页,共65页，星期六，2024年，5月方法

新鲜涂片用甲醛蒸汽固定5分钟。流水冲洗5分钟，晾干。置于基质液中37℃1小时，水洗泡10分钟。20g/L甲绿复染20－30分钟。水洗，晾干，镜检。第34页,共65页，星期六，2024年，5月临床意义

单核细胞系统呈阳性，伴随着细胞的成熟而加强，对AL有鉴别诊断作用。第35页,共65页，星期六，2024年，5月非特异性酯酶-氟化钠抑制试验同非特异性酯酶，只是在1ml作用液中，加入1.5mg氟化钠，即可抑制单核细胞的酯酶，故可作急性单核细胞白血病的鉴别诊断。

第36页,共65页，星期六，2024年，5月第37页,共65页，星期六，2024年，5月第38页,共65页，星期六，2024年，5月第39页,共65页，星期六，2024年，5月急性白血病中的组化染色

白血病POXNSEPASALL

—+

+AML

M0+——

M1+(>3原始细胞)——

M2++——

M3++++—

M4++（原单细胞）

—

M5—/+++—/+

M6+（原粒细胞）

—+（幼红细胞）

M7—++第40页,共65页，星期六，2024年，5月

中性粒细胞碱性磷酸酶染色（AKP）

第41页,共65页，星期六，2024年，5月目的鉴别白血病（低）和白血病样（高）反应鉴别淋巴肉瘤（高）和何杰金病鉴别细菌性感染（高）与病毒性感染

第42页,共65页，星期六，2024年，5月分布

血细胞的碱性磷酸酶活性，主要见于成熟的中性粒细胞，定位于胞浆中。

第43页,共65页，星期六，2024年，5月原理

细胞中的AKP在PH9.5－9.6缓冲液中能使基质中的磷酸萘酚钠水解，释放出萘酚。后者与一种稳定的重氮盐（常用有固紫Fast--Garnet，GBC或固蓝RR）偶联，生成不溶性的偶氮染料，沉积于细胞上。

第44页,共65页，星期六，2024年，5月试剂

95%乙醇固酱紫GBCAS-BI磷酸萘酚12.5mg+DH2O100ml0.2Mtris缓冲液：三羟甲基氨基甲烷2.43g+DH2O溶至100ml。0.05Mtris缓冲液（PH8.6-9.0）：0.2Mtris缓冲液25ml+0.1MHCL49ml贮存液：50mlAS-BI磷酸萘酚+PH8.80.05Mtris缓冲液50ml混匀，冰箱保存1%甲基绿

第45页,共65页，星期六，2024年，5月染色步骤

新鲜BM片及血片待干95%乙醇固定10分钟固酱紫1mg+2ml贮存液混匀，立即滴加数滴在血片或BM片上，置37℃孵箱孵育30分钟用蒸馏水快冲

放入1%甲绿中复染5分钟用蒸馏水快冲，待干，镜检

第46页,共65页，星期六，2024年，5月结果判断

阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆内。

计数方法，按碱酶活性强弱，分为0-4+共5级。分数特点

0胞浆内无红色的颗粒

1弥散的红色，偶见颗粒

2弥散的红色，有中等量的颗粒

3显著的红色，有较多的颗粒

4显著的红色，有充满胞浆的粗大颗粒第47页,共65页，星期六，2024年，5月计算积分分数细胞数目积分

0200145452255035154520总数100130=LAP积分

第48页,共65页，星期六，2024年，5月临床意义

正常的LAP积分是20－100分，但因为计数的主观性，很重要的是建立每个实验室自己的正常值。临床诊断积分正常20－100CML＜13

类白血病＞100

真红100－200

继发性红细胞增多10－100

第49页,共65页，星期六，2024年，5月第50页,共65页，星期六，2024年，5月铁粒染色第51页,共65页，星期六，2024年，5月原理

骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后而游离出来，并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内铁也可用此法显示。根据反应的强弱了解骨髓中铁的含量。

第52页,共65页，星期六，2024年，5月试剂

酸性亚铁氰化钾溶液：

200g/L亚铁氰化钾溶液5份浓盐酸1份取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓盐酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加200g/L亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消失为止，备用。2g/L核固红－硫酸铝溶液：取硫酸铝10g加入100mlDH2O再加入核固红EMER出品0.2g，置于37℃水浴中1小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。第53页,共65页，星期六，2024年，5月方法选骨髓小粒丰富的骨髓涂片玻片上滴加酸性亚铁氰化钾，染色30分钟。（可置于37℃）用DH2O冲洗后用核固红染液复染10－15分钟。流水冲洗，晾干，油镜检查。第54页,共65页，星期六，2024年，5月结果

正常人细胞外铁：＋－＋＋幼红细胞呈鲜红色，胞浆成淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。细胞外铁的判断用低倍镜观察涂片，特别时涂片尾部和骨髓小粒附近。第55页,共65页，星期六，2024年，5月细胞外铁判断标准－无颗粒＋有少数铁颗粒