DB21∕T 2451-2015 玉米品种真实性鉴定 SSR分子检测方法

ICS65.020.20DB21DB21/T2451—2015玉米品种真实性鉴定SSR分子检测方法MaizevarietygenuinenessverificationwithSSRmarkers辽宁省质量技术监督局发布IDB21/T2451—2015前言 12规范性引用文件 13术语、定义和缩略语 14方法原理 25仪器设备、试剂和溶液配制 26检测步骤 37结果分析和表示 68结果判定 6附录A（规范性附录）核心引物名称和序列 7附录B（规范性附录）溶液配制 9DB21/T2451—2015本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。本标准起草单位：辽宁省种子管理局。本标准起草人：朱志成、李波、高振环、邹畅、肖国峰、王汝宝、李洪建、赵前程、王见中、温浩、李鹏、史鸿儒、安辉、徐策、孙丽红、王东坡。1DB21/T2451—2015本标准规定了玉米品种真实性鉴定的原理、仪器设备、检测步骤及结果判定。本标准适用于玉米品种真实性SSR分子鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1.1品种真实性供检样品与该品种的对照样品是否相符。3.1.2对照样品省级以上种子管理部门收集并保存的与品种名称相符的种子样品。3.1.3参照品种已知等位变异SSR位点的品种。3.1.4SSR分子检测通过SSR分子标记检测玉米品种基因组DNA的差异，鉴定玉米品种真实性的检测方法。3.2缩略语2DB21/T2451—2015CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵。DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphates，脱氧核苷三磷酸。PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳。PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基苯磺酸钠。SSR：simplesequencerepeat，简单重复序列。Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐热DNA聚合酶。4方法原理由于不同玉米品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数存在差异，这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够鉴定玉米品种真实性。5仪器设备、试剂和溶液配制5.1仪器设备5.1.1PAGE检测平台高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计、PCR扩增仪、微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、微波炉、冰箱、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、水平摇床、胶片观察灯、凝胶成像系统或数码相机。5.1.2毛细管电泳检测平台高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计、PCR扩增仪、微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、微波炉、冰箱、DNA分析仪。5.2试剂5.2.1PAGE电泳CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、37%的盐酸、氢氧化钠（NaOH）、氯化钠（NaCl）、dNTPs、Taq酶、10×Buffer缓冲液、矿物油、去离子甲酰胺（Formamide）、溴酚蓝（BrphBlue）、二甲苯青FF、甲叉双丙烯酰胺疏水硅烷（RepelSilane）、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、甲醛。5.2.2毛细管电泳CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、37%的盐酸、氢氧化钠（NaOH）、氯化钠（NaCl）、dNTPs、Taq酶、10×Buffer缓冲液、矿物油、DNA分析仪专用丙烯酰胺胶、DNA分析仪专用分子量内标、DNA分析仪专用电泳缓冲液。5.3溶液配制3DB21/T2451—2015DNA提取、PCR扩增、电泳以及银染溶液按照附录B（规范性附录）规定的要求进行配制，所用试剂均为分析纯。试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求，其中银染溶液的配制只需达到三级水的要6检测步骤6.1送验样品及DNA提取6.1.1送验样品送验样品为种子，重量不低于200g或不少于500粒。送验样品为果穗，应不低于5个果穗(总粒数不低于500粒)；送验样品为幼苗、叶片或苞叶的，应至少含有40个个体。对于玉米自交系或单交种，可采用混合样或单个个体独立检测。混合样的试样应至少含有20个个体，单个个体独立检测的试样应至少含有5个个体。采用混合样而检测结果在某个引物位点出现异质性并影响到结果判定的，应采用单个个体独立检测，试样应至少含有20个个体。6.1.2DNA提取DNA提取方法可任选6.1.2.1至6.1.2.4所列的一种方法。DNA质量应符合PCR扩增的要求。6.1.2.1CTAB法取试样的幼苗或叶片200mg～300mg置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨，或取种子充分磨碎后，移入2.0mL离心管。每管加入700µL经65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴60min充分混匀。每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24：1）混合液，充分混合后静置10min，在12000rpm条件下离心15min。吸取上清液转移至另一离心管内，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，-20℃放置30min后在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清液，加入70%乙醇溶液，旋转2次后弃去乙醇溶液，并倒立于垫有滤纸的实验台上，室温放置10min以上。加入100µL超纯水或TE缓冲液1，充分溶解后备此方法为DAN提取的仲裁方法。6.1.2.2SDS法剪取试样的幼苗或叶片或剥取干种子的胚，置于1.5mL离心管，加入100µL氯仿后研磨，再加入300µLSDS提取液，混匀后在10000rpm条件下离心2min。吸取上清液，转移至预先装有300µL异丙醇TE缓冲液1，充分溶解后备用。6.1.2.3碱煮法剥取试样干种子的胚，或将种子培养至幼苗长度达到3cm左右时剪取每株幼苗1.5cm，放入96孔深孔板中。每孔加入150μL氢氧化钠溶液，煮沸5min，然后加入150μLTE缓冲液2，充分溶解后备用。6.1.2.4试剂盒法选用适宜SSR标记法的商业试剂盒，并经验证合格后使用。提取方法，按照提供的使用说明进行。4DB21/T2451—20156.2PCR扩增6.2.1反应体系PCR扩增反应体系的总体积可以依据具体情况确定。20μL反应体系应符合表1的要求。本标准推荐了40对核心引物，引物名称和序列见附录A。选用PAGE电泳，应合成普通引物，采用单引物电泳。选用毛细管电泳，合成引物时需在上游引物的5’端标记荧光染料，可采用单引物电泳或多引物组合电泳。对于近似品种，采用本标准推荐40对核心引物无明显差异的，可以采用能够区分的特异引物作为进行SSR检测。当使用特异引物时，应在检验报告中说明该特异引物的序列信息。表1PCR扩增反应体系原浓度终浓度ddH2O-12.3510×Buffer10×2MgCl225mmol/L2.5mmol/L2dNTP2.5mmol/Leach0.15mmol/Leach1.2Taq酶5U/μL0.220μmol/L0.25μmol/Leach0.25DNA25ng/μL2.5ng/μL26.2.2反应程序反应采用下列程序：94℃预变性5min，1次循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，进行35次循环扩增反应；72℃延伸10min。反应程序的反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而进行适当的调整。形成的扩增产物于4℃保存。6.3扩增产物检测6.3.1PAGE电泳6.3.1.1制胶制胶执行下列程序：a)蘸洗涤灵用清水将玻璃板反复擦洗干净，再用双蒸水、95%乙醇溶液分别擦洗两遍。玻璃板干燥后，将0.5mL亲和硅烷工作液，均匀涂在无凹槽的玻璃板上；将0.5mL疏水硅烷工作液，均匀涂在带凹槽的玻璃板上。操作过程中两块玻璃板分别处理，防止相互污染；b)玻璃板彻底干燥后，将塑料隔条整齐放在无凹槽玻璃板两侧，盖上凹槽玻璃板，夹子固定后，用水平仪检测玻璃胶室是否水平；c)取100mL4.5%PAGE胶，加入TEMED、25%过硫酸铵各100μL，迅速混匀，将胶灌入玻璃胶室，灌胶过程应防止气泡的出现。待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳，在室温下聚合1h以上。6.3.1.2变性5DB21/T2451—2015取20μl扩增产物（见6.2.2加入4μL6×加样缓冲液，混匀。在PCR扩增仪上运行94℃变性5min，4℃冷却10min后备用。6.3.1.3电泳电泳执行下列程序：a)正极槽（下槽）加入1×TBE缓冲液600mL，负极槽（上槽）加入经65℃预热的1×TBE缓冲液600mL，拔出样品梳，在90W恒功率下预电泳10min～20min；b)用移液器清除加样槽孔气泡和杂质，插入样品梳（鲨鱼齿朝下），每一个加样孔点入5μL样品（6.3.1.2），在80W恒功率下电泳；c)电泳时间因扩增产物预期片段大小不同而有所不同，一般来说，DNA扩增产物的预期片段，泳动到胶板中部位置，效果较好，可采用上部的二甲苯青指示带进行确定；d)达到电泳时间后关闭电源，结束电泳，取下玻璃板并轻轻撬开，通常凝胶附着在无凹槽的玻璃板上。6.3.1.4染色染色执行下列程序：a)将附着凝胶的玻璃板浸入固定液中，轻轻晃动3min后取出，在双蒸水中快速漂洗，时间不超过b)将胶板放入染色液中，轻轻晃动5min后取出，在双蒸水中快速漂洗，时间不超过10s；c)将胶板放入显影液中，轻轻晃动待条带清晰后取出，再迅速放入固定液中定影5min取出，在双蒸水中漂洗1min；d)取出胶板，晾干，放在胶片观察灯上观察，记录结果，拍照保存。注：固定液、染色液、双蒸水和显影液的用量，可依据胶板数量和大小调整，以浸过胶面为准。6.3.1.5数据记录供检样品与对照样品在同一电泳板上并排电泳时，每个位点进行逐对比较，并记录比较结果。供检样品与对照样品DNA指纹库中的指纹数据进行比较时，执行下列程序：a)将供检样品与参照品种在同一电泳板上并排电泳，逐个位点进行逐对比较，并记录比较结果。b)将该样品的纯合位点基因型数据记录为X/X，杂合位点基因型数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后，缺失位点基因型数据记录为0/0；c)与数据库中对照样品指纹数据进行比较，记录比较结果。6.3.2荧光毛细管电泳检测6.3.2.1变性分别取等体积的扩增产物和不同荧光标记的产物，混匀后从混合液中吸取1μL，加入到DNA分析仪专用96孔板孔中，各孔再分别加入0.1μL分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。在PCR仪上95℃变性5min，取出立即置于碎冰上，冷却10min以上。离心10s后备用。6.3.2.2电泳打开DNA分析仪，检查仪器工作状态，更换缓冲液、灌胶。将装有样品的微孔板放置于样品架基座上，打开数据收集软件。按照DNA分析仪使用手册进行操作，DNA分析仪将自动运行，并保存电泳数据文6DB21/T2451—20157结果分析和表示位点差异记录分为下列三种情形：——位点存在差异的或完全相同的，记录为有差异或无差异；——位点数据缺失的，记录为缺失；——位点显示无法判定的，记录为无法判定。检验结果用比较供检样品和对照样品的位点差异数目表示。统计位点差异记录的结果，计算比较位点数、差异位点数及差异位点。8结果判定供检样品和对照样品的差异位点数目≥3，，判定为与对照样品不相符。供检样品和标准样品的差异位点数目＜3，判定为与对照样品相符。属于下列情形之一的，需要在检验报告中注明：——采用的对照样品数据来自对照样品DNA指纹数据库的；——使用特异引物进行检测的，应提供该特异引物的序列信息。7DB21/T2451—2015（规范性附录）核心引物名称和序列编号引物名称染色体位置分组引物序列荧光染料P01bnlg439w1I上游：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC下游：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTCNEDP02umc1335y5I上游：CCTCGTTACGGTTACGCTGCTG下游：GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATGPETP03umc2007y42.04I上游：TTACACAACGCAACACGAGGC下游：GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACACFAMP04bnlg1940k72.08I上游：CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC下游：GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCCPETP05umc2105k33.00I上游：GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAG下游：ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCGPETP06phi053k23.05I上游：CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG下游：TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGCNEDP07phi072k44.01I上游：GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGG下游：CGTTGCCCATACATCATGCCTCVICP08bnlg2291k44.06I上游：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG下游：CATAACCTTGCCTCCCAAACCCVICP09umc1705w15.03I上游：GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG下游：CACGTACGGCAATGCAGACAAGVICP10bnlg2305k45.07I上游：CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG下游：CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTGNEDP11bnlg161k86.00I上游：TCTCAGCTCCTGCTTATTGCTTTCG下游：GATGGATGGAGCATGAGCTTGCVICP12bnlg1702k16.05I上游：GATCCGCATTGTCAAATGACCAC下游：AGGACACGCCATCGTCATCAVICP13umc1545y27.00I上游：AATGCCGTTATCATGCGATGC下游：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGTNEDP14umc1125y37.04I上游：GGATGATGGCGAGGATGATGTC下游：CCACCAACCCATACCCATACCAGVICP15bnlg240k18.06I上游：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC下游：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATACPETP16phi080k158.08I上游：TGAACCACCCGATGCAACTTG下游：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTCPETP17phi065k99.03I上游：CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC下游：GGACCCAGACCAGGTTCCACCNEDP18umc1492y139.04I下游：AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGGPETP19umc1432y610.02I上游：GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC下游：GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGCPETP20umc1506k1210.05I上游：GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG下游：TTCAGTCGAGCGCCCAACACFAMP21umc1147y4II上游：AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATAC下游：GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGCNEDP22bnlg1671y17II上游：CCCGACACCTGAGTTGACCTG下游：CTGGAGGGTGAAACAAGAGCAATGFAM8DB21/T2451—2015P23phi96100y12.00II上游：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG下游：CCATCTGCTGATCCGAATACCCFAMP24umc1536k92.07II上游：TGATAGGTAGTTAGCATATCCCTGGTATCGNEDP25bnlg1520K12.09II上游：CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACC下游：GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTGFAMP26umc1489y33.07II上游：GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC下游：GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGTNEDP27bnlg490y44.04II上游：GGTGTTGGAGTCGCTGGGAAAG下游：TTCTCAGCCAGTGCCAGCTCTTATTANEDP28umc1999y34.09II上游：GGCCACGTTATTGCTCATTTGC下游：GCAACAACAAATGGGATCTCCGFAMP29umc2115k35.02II上游：GCACTGGCAACTGTACCCATCG下游：GGGTTTCACCAACGGGGATAGGVICP30umc1429y75.03II上游：CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC下游：GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTGVICP31bnlg249k26.01II上游：GGCAACGGCAATAATCCACAAG下游：CATCGGCGTTGATTTCGTCAGVICP32phi299852y26.07II上游：AGCAAGCAGTAGGTGGAGGAAGG下游：AGCTGTTGTGGCTCTTTGCCTGTVICP33umc2160k37.01II上游：TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG下游：CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATTVICP34umc1936k47.03II上游：GCTTGAGGCGGTTGAGGTATGAG下游：TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTCPETP35bnlg2235y58.02II上游：CGCACGGCACGATAGAGGTG下游：AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCTVICP36phi233376y18.09II上游：CCGGCAGTCGATTACTCCACG下游：CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTCPETP37umc2084w29.01II上游：ACTGATCGCGACGAGTTAATTCAAAC下游：TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGCNEDP38umc1231k49.05II上游：ACAGAGGAACGACGGGACCAAT下游：GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTCFAMP39phi041y610.00II上游：CAGCGCCGCAAACTTGGTT下游：TGGACGCGAACCAGAAACAGACPETP40umc2163w310.04II上游：CAAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTC下游：CTTCGTACCATCTTCCCTACTTCATTGCNED9DB21/T2451—2015（规范性附录） 溶液配制B.1DNA提取B.1.10.5mol/LEDTA溶液186.1gNa2EDTA.2H2O溶于800mL水中，用固体NaOH调pH值至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。B.1.21mol/LTris-HCl溶液60.55gTris碱溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，定容至500mL，高压灭菌。B.1.30.5mol/LHCl溶液25mL浓盐酸(36-38%)，加水定容至500mL。B.1.4CTAB提取液81.7g氯化钠和20gCTAB溶于适量水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/LEDTA40mL，定容至1000mL，4℃贮存。B.1.5SDS提取液1mol/LTris-HCl50mL，0.5mol/LEDTA50mL，5mo