检验方法汇编

第四部分冰淇淋微生物检验方法

一、大肠菌群检验...................................第110页

二、菌落总数的测定.................................第117页

三、嗜冷菌的检测...................................第120页

四、单核细胞增生李斯特氏菌的检验...............…第120页

五、涂抹检验.......................................第125页

六、空气净度检验...................................第126页

七、水样的检测.....................................第127页

一、大肠菌群检验（依据国标GB/T4789.3-2003）

（一）概念：

大肠菌群：经37C24h培养，能发酵乳糖，产酸、产气，需氧或兼性厌气的（T

无芽胞杆菌。该菌主要条件来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价

食品的卫生质量，推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数系以100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。

（二）培养基配制：

1.乳糖胆盐发酵管：

成分：蛋白腺20g

胆盐5g

乳糖10g

0.04%溪甲酚紫水溶液25ml

蒸溜水1000ml

PH7.4

制法：将蛋白陈、胆盐及乳糖溶于水中，校正PH加入指示剂，分装每管10ml,

并放入一个小倒管，115c高压灭菌15nlin。

注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸僧水外，其它成分加倍。

2.乳糖发酵管：

成分：蛋白脓20g乳糖10g0.04%漠甲酚紫水溶液25ml

蒸溜水1000mlPH7.4

制法：将蛋白腺及乳糖溶于水中，校正PH值，加入指示剂，分装3—5ml,并

放入一个小倒管，115C高压灭菌15min。

3.伊红美蓝培养基：

成分：

蛋白陈10g

乳糖10g

磷酸氢二钾2g

琼脂17g

2%伊红水溶液20ml

0.65%美蓝水溶液13ml

蒸屈水1000ml

pH为7.1

制法：

将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于热蒸偌水中，校正pH,分装于烧瓶内，121C

高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55C,加入伊

红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

（四）操作程序:

1.检样稀释

(1)以无菌操作将检样25ml(g)放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液

的灭菌玻璃瓶内或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成上10的均匀稀释液。固

体检样最好用均质器，以8000-10000r/min的速度处理Imin,做成1:10的均匀

稀释液。

(2)用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml,注入含有9ml灭菌生理盐水或其他

稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1:100的稀释液。

(3)另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一

次，换用1支1ml灭菌吸管。

(4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个

稀释度接种3管。

3.乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖

胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,

置36±1C温箱内，培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告

为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

3.分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1C温箱内，培

养18-24h,然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。

菌落形态：

I紫黑色，有金属色泽

n紫黑色，无金属色泽

川中心紫黑色，外缘为粉红色

4.证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种

乳糖发酵管，置36±1C温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、

革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

革兰氏染色：挑取可疑菌落

灭菌盐水一取菌一火焰上固定一结晶紫染色Imin水洗一革兰氏碘液染色

Iniini水洗-95%乙醇染色30S-水洗-复染液染色Imin-水洗一待干一镜检。

大肠菌群采用三步法(初发酵，分离培养和证实试验)

第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发

酵阳性管，经平板分离和证实实验后，有时可能成为阴性。因此，初发酵与证

实实验相差较大。

5.报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)大肠

菌群的MPN值。

6.注意事项：

(1)乳糖胆盐发酵管内有无倒立小导管，且观察小倒管内是否有气泡。

(2)小导管不能缺裂，口不能被堵。

(3)平板分离：挑取菌落3—5个。

(4)加样液时要沿管壁缓慢加入，防止小倒管里冲入气泡。

(5)加入样液时一定要混匀。

(五)染色法：

1.美兰染色法：

(1)吕氏美蓝染色液

美蓝0.3g95%乙醇30ml0.01%氢氧化钾溶液100ml

将美蓝溶解于乙醇中，然后于氢氧化钾溶液混合。

(2)染色法

将涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液，染「3分钟，水洗，待干，镜检。

(3)结果：菌体呈兰色。

2.革蓝氏染色法：

(1)原理：G-菌(革兰氏阴性菌)细胞壁厚，细胞壁中脂类化合物多，含肽聚

糖少，酒精溶解脂类，细胞壁通透性好，酒精可以碘和结晶紫的复

合物溶出，番红进入一红色。

G+菌(革兰氏阴性菌)细胞壁薄，细胞壁中脂类化合物少，含肽聚

糖多，细胞壁通透性差，碘和结晶紫的复合物滞留一蓝紫色。

(2)染液的配制：

1）结晶紫染液：结晶紫1g+95%乙醇20ml+1%草酸铁水溶液80ml,将结晶

紫溶解于乙醇中，然后与草酸镀溶液混合。

2）革蓝氏碘液：碘lg+碘化钾2g+蒸储水300ml,将碘与碘化钾先进行混合,

加入蒸储水少许，充分振摇，等完全溶解后，再加蒸偏水至300ml。

3）沙黄复染液：沙黄0.25g+95%乙醇10ml+蒸屈水90ml,将沙黄溶解与乙

醇中，然后用蒸储水稀释。

（3）染色法：

1）用接菌环取一滴灭菌生理盐水于载玻片上，然后再用灭菌环挑取少量菌种于

载玻片上与生理盐水充分混合。

2）涂片自然干燥或在火焰上固定，滴加结晶紫，染1分钟水洗。

3）滴加革蓝氏碘液，作用1分钟，水洗。

4）滴加95%乙醇脱色，约30秒；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇

滴满整个涂片，脱色10秒。

5）水洗，滴加复染液，复染1分钟。水洗，待干，镜检。

（3）结果：革蓝氏阳性菌呈紫色。革蓝氏阴性菌呈红色。

附：大肠菌群最可能数（MPN）检索表

阳性管数MPN95%可信限

1ml(g)x30.1ml(g)x30.01ml(g)x3100mL(g)下限上限

000<30

00130<590

00260

00390

01030<5130

01160

01290

013120

02060

02190

022120

023160

03090

031130

032160

033190

10040<5200

1017010210

102110

103150

1107010230

11111030360

112150

113190

12011030360

121150

122200

123240

130160

131200

132240

133290

2009010360

20114030370

202200

203260

21015030440

21120070890

212270

213340

22021040470

2212801001500

222350

223420

230290

231360

232440

233530

300230401200

301390701300

3026401503800

303950

310430702100

3117501402300

31212003003800

3131600

3209301503800

32115003004400

32221003504700

3232900

330240036013000

331460071024000

33211000150048000

333>24000

注：(1)本表采用3个稀释度(1ml(g)、0.1ml(g)、0.01ml(g)),每稀释

度3管。

(2)表内所列检样量如改用10ml(g)、1ml(g)、O.lml(g)时，表内的数

字应相应降低10倍，如改用0.1ml(g),0.01ml(g),0.001ml(g)时，则表内

数字应相应增加10倍。其余可类推。

二、菌落总数的测定(依据国标GB/T4789.2-2003)

(一)概念：

菌落总数：是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分培养

温度和时间、PH值、需氧性等)所取lml(g)检样中所含菌落的总数。

主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌对食

品被污染程序的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品繁殖的动态，以便

对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

(二)培养基：

营养琼脂：

成分：蛋白脓10g

牛肉膏3g

氯化钠5g

琼脂15-20g

蒸偏水1000ml

制法：将除琼脂以外的成分溶解于蒸僧水内，加入15%氢氧化钠溶液约2ml校

正PH至7.2-7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121C

高压灭菌15分钟。(注：现化验室用直接配制好的营养琼脂混合物)

(三)操作步骤：

(1)以无菌操作，将检样25g(25ml)剪碎放于含有225ml,灭菌生理盐水或其

他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体

检样最好用均质器，以8000-10000r/min的速度处理Imin,做成1:10的均匀稀

释液。

(2)用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生

理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试

管，混合均匀，做成1:100的稀释液。

(3)另取1ml灭菌吸管，按上面操作顺序，做10递增稀释液，如此每增加一

次，即换用1支1ml灭菌吸管。

(4)根据样品卫生标准要求或对样本污染情况进行估计，选择2-3个适宜稀释

度，分别在做1。倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液

于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。

(5)稀释液移入平皿后，应及时(从检样稀释到倾注平板不超过20nlin)将凉

至46C营养琼脂培养基注入平皿内15ml,并转动平皿使混合均匀。同时，将营

养琼脂培养基倾入不加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。

(6)待琼脂凝固后，翻转平板，置36土1C温箱内培养48±2h。

注意事项：

(1)操作要快而准，包括材料、加样、倒培养基。

(2)吸液体时液体不能进入吸头。

(3)样品稀释时一定要混匀。

(4)倒培养基前，瓶口要过火焰。

(5)一定要有空白对照。

(6)培养基温度控制，培养基薄厚。

(7)检测时一定要使平皿完全暴露于空气中。

2、检测完要迅速进行培养。

(四)菌落计数的方法

(1)平板菌落数的选择

选取菌落数在30—300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使

用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌数生长时，

则不宜采用，应以无片状菌数生长的平板柞为该稀释度的菌落数，若片状菌落

不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2

代表全皿菌落数，平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)若仅有

一条链，可视为一个菌落，如有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌

落计。

(2)稀释度的选择

①应选择平均菌落数在30—300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告。

②若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30~300之间，则视两者之比如何来决

定，若其比值小于或等于2,应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的数字。

③若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应以稀释度最高的平均菌落数乘

以稀释倍数报告。

④若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀

释倍数报告。

⑤若所有稀释度无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

⑥若所有稀释度的平均落菌数均不在30~300之间，其中一部分大于300或小于

30时，则以最接近30或300平均菌落数乘以稀释倍数。

(3)菌落数的报告

菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时采用两位有效数字，

在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数,

也可以用10的指数来表示。(见下表)

稀释度选择及菌落数报告方式

例稀释液及菌落数两稀释菌落总数报告方式

次10-'ICTIO"液之比(cfu/g或ml)(个/g或ml)

1多不可计16420—1640016000或1.6x10,

2多不可计295461.63775038000或3.8xlO4

3多不可计271602.22710027000或2.7x4

4多不可计多不可计313—31300031000或3.1x105

527115—270270或2.7x102

6000—<1x10<10

7多不可计30512—3050031000或3.1xlO4

三、嗜冷菌的检测

（一）培养基：

CVT培养基配制：

成分：酵母浸膏2.5g,蛋白脓5.0g,结晶紫0.002g,琼脂条冬季加15g、夏季

加20g,TTC0.05g,葡萄糖LOg,蒸镭水1000ml。

制法：在未加琼脂条和指示剂前、在室温下用4%的氢氧化钠调PH=7.0,溶解后,

再15P,20分钟条件下高压灭菌。

（二）操作步骤：

1.以无菌操作称取检样25g（或25ml）,放入含有225ml灭菌水的三角瓶中，

振摇30min,即为1：10稀释液。

2.用灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml注入含有9nli无菌生理盐水的试管中，

即为1：100稀释液。依此类推，做成稀释倍数为1：1000和1：10000的稀释

液，做一次递减稀释液换一次吸管。

3.用无菌管吸取1ml1:1000的稀释液于灭菌平皿中，作2个平皿；再吸取1:

10000的稀释液1ml于灭菌平皿中，作2个平皿。

1.将凉至45c左右的嗜冷菌培养基（最好是CVT培养基）注入平皿中，待凝固

后，倒置于厂10C冰箱中，培养10天后开始计数。

（三）菌落计数方法：见国标GB/T4789.2-2003菌落总数的测定中7.3菌落计

数的报告（即菌落总数记数方法）。

（四）菌落形态：呈红色或紫色。

四、单核细胞增生李斯特氏菌的检验（依据国标GB/T4789.29-2003）

1培养基：

1.1含0.6%酵母浸膏的胰酪腺大豆肉汤（TSB-YE）

1.1.1成分：

胰豚17g,多价陈3g,酵母膏6g,氯化钠5g,磷酸氢二钾2.5g,葡萄糖2.5g,

蒸偏水1000mL

1.1.2制法：将上述各成分加热搅拌溶解，调至PH7.2—7.4,分装，121C高压

灭菌15min,备用。

1.2含0.6%酵母浸膏的胰酪脓大豆肉汤（TSA-YE）

1.2.1成分：

胰豚17g,多价脓3g,酵母膏6g,氯化钠5g,磷酸氢二钾2.5g,葡萄糖2.5g,

琼脂15g,蒸储水1000mL

L2.2制法：将上述各成分加热搅拌溶解，调至PH7.2—7.4,分装，121C高压

灭菌15min,备用。

1.3EB增菌液

1.3.1成分：

胰腺17g,多价脓3g,酵母膏6g,氯化钠5g,磷酸氢二钾2.5g,葡萄糖2.5g,

蒸镭水1000mL,盐酸丫唳黄15mg/L,蔡唳酮酸40mg/L

1.3.2制法：除盐酸丫唉黄和蔡唳酮酸外，其余成分加热混合，调PH至7.2-7.4,

分装，121℃高压灭菌15min.使用前加盐酸丫唳黄15mg/L和蔡唳酮酸40mg/L,

此两种成分要无菌配制或过滤除菌。

1.4李氏增菌液（LB.,LBJ

1.4.1成分：

胰脓5g,多价脓5g,酵母膏5g,氯化钠20g,磷酸二氢钾1.35g,磷酸氢二钠

12g,七叶昔1g,蒸储水1000mL

1.4.2制法：将上述各成分加热溶解，调PH至7.2—7.4,分装，121C高压灭菌

15mino

1.4.2.1李氏I液（LBQ200mL加入：

1%蔡嘴酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.45mL

1%盐酸丫唳黄（用灭菌蒸偏水配制）0.27mL

1.4.2.2李氏II液（LB2）200mL加入：

1%蔡唳酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.40mL

1%盐酸丫唳黄（用灭菌蒸偏水配制）0.50mL

无菌分装于10疝大试管中。

L5三糖铁（TSI）琼脂：GB/T4789.28-2003中4.26、27.

1.5.1成分

蛋白陈20g,牛肉膏5g,乳糖10g,蔗糖10g,葡萄糖1g,氯化纳5g,

硫酸亚铁镀[Fe（NH4）2（SO4）2-6H2O]0.2g,硫代硫酸钠0.2g,琼脂12g,

酚红0.025g,蒸福水1000mL,pH7.4

1.5.2制法

将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸僧水中，校正pH。加入琼脂，加热

煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5ml,摇匀。分装试管，装量宜多

些，以便得到较高的底层。121C高压灭菌15min,放置高层斜面备用。

1.6SIM动力培养基

1.6.1成分：

胰腺20g,多价脓6g,硫酸铁锭0.2g,硫代硫酸钠0.2g,琼脂3.5g,蒸福水

1000mL

1.6.2制法：将上述各成分加热混合，调「^!至7.2,分装小试管，121C高压灭

菌15mino

1.7血琼脂:GB/T4789.28-2003中4.6。

1.7.1成分：

豆粉琼脂(PH7.4-7,6)100mL,脱纤维羊血(或兔血)510mL

1.7.2制法:加热溶化琼脂，冷却50℃,以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注

平板.亦可分装灭菌试管，置成斜面.亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血

琼.

1.8改良的MeBride(MMA)琼脂

1.9硝酸盐培养基：GB/T4789.28-2003中3.17。

1.9.1成分：

硝酸钾0.2g,蛋白陈5g,蒸僧水1000mL,PH7.4。

1.9.2制法：熔解，校正PH,分装试管，每管约5疝，121C高压灭菌15min。

1.9.3硝酸盐还原试剂：

甲液：对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/l乙酸溶液100mL中。

乙液：甲蔡胺0.5g溶解于2.5mol/l乙酸溶液100mL中。

L9.4试验方法：

接种后在36±1C培养1—4天，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原

为亚硝酸盐时于于立刻或数分钟内显红色。

注：本试验阴性原因有三：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和

氮；培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再

加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。

1.10缓冲葡萄糖蛋白脓水：GB/T4789.28-2003中3.4。

1.10.1成分：磷酸氢二钾5g、多膝7g、葡萄糖5g、蒸^水1000mL、PH7.0。

L10.2制法：加热熔解，校正pH。分装试管，每管1mL,121C高压灭菌15min。

1.11糖发酵培养基：GB/T4789.28-2003中3.2。

1.11.1成分:牛肉膏5g,蛋白腺10g,氯化钠3g,磷酸氢二钠(Na2HPO4-12H2O)

2g,0.2%滇麝香草酚蓝溶液12mL,蒸储水1000mL,pH7.4

1.11.2制法：

1.11.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个

倒置小管的小试管内，121C高压灭菌15min。

1.11.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100矶，121C高压

灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加

入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。

注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

1.11.3试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36±1C培养，一般

观察2~3d。迟缓反应需观察14~30d。

1.12Rustigian尿素培养液：GB/T4789.28-2003中4.38。

1.12.1成分：

尿素20.0g,酵母浸膏0.1g,磷酸二氢钾0.091g,磷酸氢二钠0.095g,酚红0.01g,

蒸僧水1000mL

1.12.2制法：

将上述成分于蒸像水中溶解，校正PH为6.8±0.2。不要加热，过滤除菌，无菌

分装于灭菌小试管中，每管约为3mLo

1.131%盐酸丫唳黄溶液:用灭菌蒸偏水配制

1.141%秦唉酮酸钠盐溶液:用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制

2操作步骤：

2.1样品的收集及处理

无菌取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分

搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4C冰箱。

2.2增菌培养

EB增菌液放30±1C培养48h,LB1增菌液225mL放30±「C培养24h,吸0.1mL,

加入10mLLB2增菌液中二次增菌。

2.3分离培养

将EB增菌液和LB2二次增菌液，分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养

30±TC48h,调取可疑菌落，在白炽灯45角斜射光照射平板，李斯特氏菌的

菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形菌落。

2.4选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TSI)琼脂和SIM动力培养基，培

养于25±1C,观察是否有动力，且成伞状或月牙状生长。一般观察2—7天，阳

性者可做下一步鉴定。

2.5纯培养

将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产生

硫化氢的可疑培养物接种于胰酪陈大豆琼脂培养基(TSA-YE)上纯培养，做以

下鉴定。

2.6染色镜检

将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小

-

杆菌，大小为(0.4~0.5m)x(0.52.0Mm);生理盐水制成菌悬液，在油镜

或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

2.7生化特性

将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性

及其种间的区别见表1。

表1单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别

溶血硝酸盐尿素MR-V甘露鼠李七叶

菌种木糖

反应还原酶P醇糖昔

单核细胞增生李

+——+/+—+—4-

斯特氏菌

绵羊李斯特氏菌4-——+/+——++

英诺克李斯特氏

———+/+—V—4-

菌

威尔斯李斯特氏

———+/+—V+4-

菌

西尔李斯特氏菌4-——+/+——4-+

格氏李斯特氏菌———+/++——+

默氏李斯特氏菌—+—+/++V—+

注：V反应不定；+阳性；-阴性。

五、涂抹检验

（一）涂抹操作规程：

1.进入车间先经过消毒池消毒；

2.在洗手池洗手消毒；

3.涂抹前用75%的酒精棉球消毒手和镶子；

4.用消毒镶子取25cm2湿润灭菌涂抹纸（或涂沫棒），贴（或涂）于被涂抹

物表面，使之充分接触，贴完50cm2后，立即放入装有50ml灭菌生理盐水

的三角瓶中，盖好瓶塞，使涂抹纸与盐水充分混合并做好标识，在4h内进

行菌落总数和大肠菌群的测定。

（二）菌落总数的测定：

1.检样前使三角瓶内生理盐水与涂抹纸充分摇匀，使之充分接触。

2.用1ml灭菌吸管吸取1ml液体，注入灭菌平皿内且做两个平皿。

3.及时将凉至46C营养琼脂培养基注入平皿约15ml,并转动平皿（沿同一方向）

使混合均匀。

4.待琼脂凝固后，翻转平板置36±1℃温箱内培养48±2h。

（三）大肠菌群的测定：

用10ml灭菌吸管吸取10ml液体，沿管壁缓缓注入装有10ml双料乳糖胆盐

发酵管内，接种3个试管；

用1ml灭菌吸管吸取1ml液体，沿管壁缓缓注入装有10ml单料乳糖胆盐发

酵管内，接种3个试管；

用1ml灭菌吸管吸取1ml液体，沿管壁缓缓注入装有9ml生理盐水的试管

内，混匀做成1:10的稀释液；

用1ml灭菌吸管吸取Imll：10的稀释液，沿管壁缓缓注入装有10ml单料

乳糖胆盐发酵管内，接种3个试管；

做好标记置于36±1℃温箱内培养24±2ho

（四）芽袍耐热芽施检验

1.用10ml灭菌吸管吸取10ml检样分别于两个灭菌试管内，盖紧棉塞，做好标

识。

2.另取两试管装入10ml水，分别插入温度计1支。

3.将上述试管同时放入水浴中，待温度计温度升至80C（芽袍检验温度）或100C

（耐热芽袍检验温度）开始计时，10分钟后取出，立即冷却至室温。

4.用1ml灭菌吸管吸取1ml检样于灭菌平皿内，做两个平皿。

5.将凉至46C左右的镒盐营养琼脂（每1000ML普通营养琼脂中加硫酸镒

（3.08gMnS04+100mlH20）lml）培养基注入平皿内约15ml,充分转动摇匀。

6.芽抱测定将平皿翻转置36±1℃温箱内培养60—62ho

耐热芽抱测定将平皿翻转置55±2C温箱内培养60—62ho

注意事项：

1.保证涂抹面积50平方厘米。

2.操作前要对手和镶子彻底消毒。

3.要保证在4小时内进行检测。

六、空气净度检验

1.在无菌条件下，把冷至46C的灭菌营养琼脂（或其它培养基）倾入灭菌平皿

内.

2.待完全凝固后，置检测目的地暴露15分钟.

3.翻转平板置36±1C温箱内培养48±2小时（针对营养琼脂，其它培养基按对

应检测菌类的培养条件和时间进行培养）.

注意事项：

1.检测时一定要使平皿完全暴露在空气中.

2.检测完要及时进行温箱培养.

3.检测时要保证时间的准确性.

七、水样的检测

(-)总大肠菌群

在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指

标，而不是直接测定肠道致病菌。

总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37C生长时能使乳糖发酵，在

24h内产酸气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群数系指每升水样中所含有的

总大肠菌群的数目。

总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。

多管发酵法：

1.应用范围

(1)本法适用于饮用水、水源水，特别是混浊度含量高的水质中总大肠菌群的

测定。

(2)水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程序，而且间接地表明

有肠道致病菌存在的可能性。

2.原理

根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽抱杆菌，在37C24h

内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。

3.培养基：乳糖蛋白脓培养液

成分：

蛋白腺10g

牛肉膏3g

乳糖5g

氯化钠5g

1.6%溪甲酚紫乙醇溶液1ml

蒸偏水1000ml

制法：

将蛋白腺、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸偏水中加热熔解，调整PH

值为7.2—7.4,再加入1ml1.6%澳甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒

管的试管中，置高压蒸灭菌器中，以115C灭菌20nlin,贮存于冷暗处备用。

4.检测步骤：

采用15管法发酵：

前5管：吸原液10ml于5ml乳糖蛋白陈培养液三料中

中5管：吸原液1ml于10ml乳糖蛋白脓培养液单料中

后5管：吸IO"倍液imi于10ml乳糖蛋白腺培养液单料中

其他如普通大肠菌的测定

5.报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，总大肠菌数（MPN）检数表，

报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。（标准0个）

总大肠菌数（MPN）检数表（GB5750-85）

（总接种量55.5ml,其中5份10ml;5份1ml水样；5份0.1ml水样）

接种量，ml每100ml水样中接种量，ml每100ml水样中

总大肠菌群近总大肠菌群近

1010.11010.1

似数似数

00000408

00120419

002404211

003504313

004704415

005904517

01020509

011405111

012605213

013705315

014905417

0151105519

02041002

02161014

02271026

02391038

0241110410

0251310512

03061104

03171116

03291128

0331111310

0341311412

0351511514

续表1

接种量，ml每100ml水样接种量,ml每100ml水样

中总大肠菌群中总大肠菌群

1010.11010.1

近似数近似数

12062005

12182017

122102029

1231220312

1241520414

1251720516

13082107

131102119

1321221212

1331521314

1341721417

1351921519

140112209

1411322112

1421522214

1431722317

1441922419

1452222522

1501323012

1511523112

1521723217

1531923320

1542223422

1552423525

续表2

接种量，ml每100ml水样接种量，ml每100ml水样

中总大肠菌群中总大肠菌群

1010.11010.1

近似数近似数

2401532014

2411732117

2422032220

2432332324

2442532427

2452832531

2501733017

2512033121

2522333224

2532633328

2542933432

2553233536

300834021

3011134124

3021334228

3031634332

3042034436

3052334540

3101135025

3111435129

3121735232

3132035337

3142335441

3152735545

续表3

接种量，ml每100ml水样接种量，ml每100ml水

中总大肠菌群样中总大肠

1010.11010.1

近似数菌群近似数

4001344034

4011744140

4022144247

4032544354

4043044462

4053644569

4101745041

4112145148

4122645256

4133145364

4143645472

4154245581

4202250023

4212650131

4223250243

4233850358

4244450476

4255050595

43