小麦及其制品中转基因成分普通PCR和实时荧光PCR定性检验方法编制说明

《小麦及其制品中转基因成分普通PCR和实时荧光PCR定性检测方法》国家标准编制说明一、任务来源和制标依据本国家标准方法的制订是根据国家标准委下达的标准制订计划（编号20071660-T-449），在完成了两项科研课题和一项检验检疫行业标准的基础上由黑龙江出入境检验检疫局负责起草的。本标准是按照GB/T1.1-2000《标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则》的要求进行编写的。二、编制本标准的目的和意义由于小麦的遗传基因非常复杂，所以转基因小麦品种的研究比其它作物花费了更长的时间。2001年美国孟山督公司获得世界第一株抗草甘膦除草剂转基因小麦品系(RoundupReadyWheat)，并于2005年6月在美国FDA申请注册登记，计划2006年后进行商业化种植；美国氰胺公司创制的抗咪唑啉酮(IMI-Wheat)除草剂转基因小麦，德国艾格福公司创制的抗草铵膦（LibertyLinkWheat）除草剂转基因小麦，还有其它抗病、抗虫和改良品质的转基因小麦品种也相继问世。目前商品化的转基因小麦是1999年加拿大批准食用的SWP965001品系，它是通过化学诱变获得的抗硫苯脲除草剂的作物。我国的转基因小麦有改良品质的（优质HMV谷蛋白亚基），抗穗发芽，抗蚜虫（GAN），双价抗病基因，抗除草剂的等等品系。目前我国已经被批准进入生产试验的是改良品质的转基因小麦。如本课题研究的提高小麦面筋含量并改善面包的烘烤品质的高分子量谷蛋白亚基转基因小麦品系B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2。目前，国际上主要的粮食作物ISO标准中没有转基因小麦的检验方法标准，而我国国家标准（GB/T）和现有的农业行业标准及检验检疫标准（SN/T）中也没有转基因小麦的检测方法标准。为此，国家质检总局和国家科技部非常重视，于2004年分别下达给我局科研项目《转基因小麦定性定量PCR检测方法研究》（编号2004IK084）和《转基因小麦的基因鉴别技术研究》（编号202DIA50034-03）。国家质检总局同时下达了检验检疫行业标准，（编号B117-2003）。因此迫切需要尽快研究建立转基因小麦的定性定量PCR检测方法。本标准方法是建立在由黑龙江局承担并完成了两项（国家质检总局科技司2004年《转基因小麦中定性定量PCR检测方法研究》课题（编号2004IK084）和国家科技部2002年度社会公益研究专项重点项目《影响食物安全的生物种类基因鉴别技术研究》中的2004年子课题《转基因小麦的基因鉴别技术研究》（编号202DIA50034-03））科学研究的成果基础上，同时完成了一项检验检疫行业标准SN/T1943-2007《小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR检测方法》的前提下完成制订并起草的。该检测方法除了我们建立的行业标准外，目前在国内外一直是空白。因此急需建立我国转基因小麦的PCR定性检测的国家标准，以满足我国进出口小麦及其制品转基因成分检验需求。黑龙江局在标准的研究过程中，针对目前的转基因作物中转基因小麦的特殊性（六倍体作物），不仅在国内外首次找到了小麦属的内源基因GAG56D，而且对转基因小麦的外源基因（nos（终止子），ubiquitin（启动子），bar，uidA）和Wx012内源基因同时进行了理论blast比对和普通PCR和实时荧光PCR的实验验证。特别是针对目前检验检疫行业普遍使用的ABI和LighCycler等荧光PCR仪器进行了PCR体系和扩增条件的探索研究实验，同时对转基因小麦及其制品和设计的引物和探针的检测特异性、灵敏度和检测低线进行了研究，并对所建立的该国家标准方法进行了应用研究，建立了可行、稳定、特异、快速的PCR检验方法。经过了检验检疫系统内实验室和高等学校及科研单位等社会实验室验证，结果准确稳定可靠。经光盘文献检索,除了本制标人制订的检验检疫行业标准SN/T1943-2007《小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR检测方法》外，未查到国内外相关的转基因小麦PCR检测方法标准的报道。三、建立本标准方法的实验研究1材料与方法1.1试验材料与来源1.1.1转基因小麦材料：提高小麦面筋含量并改善面包的烘烤品质的高分子量谷蛋白亚基B73-6-1（简写为B73），B72-8-11b（简写为B72）和B102-1-2（简写为B102）转基因小麦品系（来源于华中科技大学）。1.1.2特异性试验的非转基因作物材料：冬小麦京花1号；春小麦（简写为Mck）等品系；普通小麦样品（简写为M1，M2）一粒小麦,二粒小麦，硬粒麦，斯卑尔脱小麦，山羊草，大麦，荞麦，燕麦，谷子，水稻（白米，黑米），大豆，玉米，油菜，亚麻等分别来源于北京农林科学院，中国农业科院品种资源所，黑龙江农业科院小麦所，东北农业大学。1.1.3实验样品的制备A．实验样品：A1.转基因小麦和制品的阳性实验材料：转基因小麦B73和非转基因小麦京花1号分别称重后，用105℃水分测定法烘至水分一致后，分别用液氮冷冻研磨机充分研磨成粉末状，然后将B73和京花1号样品按重量比，分别配制成含有1%，0.5%，0.1%，0.05%转基因小麦B73成分样品用于做小麦外源基因检测灵敏度。再用1%B73转基因小麦样品分别按照制作油条和面包简单工艺加工制作成1%B73转基因小麦油条和1%B73转基因小麦面包A2.非转基因小麦样品：非转基因小麦京花1号小麦和非转基因大米分别称重后，用105℃水分测定法烘至水分一致后，分别用液氮冷冻研磨机充分研磨成粉末状，然后将京花1号和大米样品按重量比，分别配制成含有0.5%，0.1%，0.05%京花1号小麦成分样品用于做内源基因灵敏度检测A3.其它样品材料：米粉,豆粉，大米、饼干、婴儿麦粉、方便面、燕麦片均来自实验室检测样品。1.1.3试剂、仪器、引物探针、PCR反应体系和条件等均按照该转基因小麦国家标准方法中规定进行操作。2、转基因小麦普通定性PCR检测方法的建立2.1小麦属GAG56D内源基因特异性的检测通过genebank中编号为10638295搜索和比对分析找出了小麦内参照γ-麦谷醇溶蛋白基因GAG56D（genebank号为GI：10638295），并用设计并合成的扩增该基因的引物对实验材料进行PCR扩增，发现转基因小麦和非转基因小麦样品,二粒小麦，硬粒麦，山羊草，斯卑尔脱小麦均被扩增出328bp的PCR产物，空白对照和其它作物中没有扩增出目的片断（图1）。说明γ-麦谷醇溶蛋白内源参照基因只是小麦属中特有的内参照基因。同时我们用荧光定量PCR也进一步验证了实验结果。图1GAG56D基因PCR扩增结果1：DL2000，2：B73，3：京花1号小麦，4：硬粒麦，5：油菜籽，6：亚麻，7：二粒小麦，8：山羊草，9：斯卑尔脱小麦图1GAG56D基因PCR扩增结果1：DL2000，2：B73，3：京花1号小麦，4：硬粒麦，5：油菜籽，6：亚麻，7：二粒小麦，8：山羊草，9：斯卑尔脱小麦，10：荞麦，11：大豆，12：玉米粉，13：大米粉，14：黑米，15：小米，16：空白对照。扩增片段328bp。12345678910111213141516250bp250bp500bp2.2小麦内源Wx012基因特异性的检测通过大量文献查询，我们选择了Wx012基因作为小麦物种特异内参照基因，该基因是被实验验证了的单拷贝或低拷贝内源参照基因[1]。文献作者针对Wx012基因设计了多组引物，对黑麦，山羊草，意大利小米，普通小米，大豆，小麦，水稻，玉米，芝麻，硬粒麦，油菜籽，芝麻等作物进行PCR扩增，最终选择了一对扩增片段长度为102bp的引物，该基因除小麦外，在其它作物中都没有扩增。本研究在以上文献的研究基础上进行了补充研究，对转基因小麦（B73）,京花1号，荞麦，燕麦片进行了PCR扩增,发现在转基因小麦和京花1号中出现102bp扩增片段，在荞麦和燕麦片中没有（图2）。123456123456250bp100bp250bp100bp500bp图2Wx012基因特异性PCR检测结果1：水空白对照；2：京花1号小麦；3：荞麦；4：燕麦片；5：B73；6：DL2000；扩增片断长度102bp。2.3小麦及其制品外源NOS基因（终止子）的检测采用欧盟推荐的NOS基因引物（扩增片段长度180bp），以含有NOS终止子的B73为阳性对照，对0.1%转基因小麦粉，1%转基因油条，1%转基因面包和非转基因小麦京花1号和市售方便面的总DNA样品进行PCR扩增，得到预期的180bp的PCR扩增片段（图3），用实时荧光PCR验证出现预期的扩增曲线。图3NOS基因PCR检测结果1：100bpDNAladdermarker；2：B73；3：水空白对照；4：图3NOS基因PCR检测结果1：100bpDNAladdermarker；2：B73；3：水空白对照；4：1%转基因面包；5：1%转基因油条；6：0.1%转基因小麦粉；7：京花1号小麦；8：市售方便面。扩增目的片断大小180bp。12345678100bp100bp500bp2.4小麦及其制品外源ubiquitin基因（启动子）的检测及特异性的鉴定2.4.1针对转基因小麦genbank中编号为AY572837.1GI:45862532的ubiquitin启动子的序列设计了一对扩增长度为314bp的引物，对0.1%转基因小麦粉，1%转基因油条、1%转基因面包和非转基因小麦京花1号和市售方便面的总DNA样品进行扩增，得到预期的片段（图4）。用实时荧光PCR验证，出现预期扩增曲线。12345671234567500bp100bp500bp100bp图4Ubiquitin基因PCR检测结果1：100bpDNAladdermarker；2：水空白对照；3：0.1%转基因小麦粉；4：1%转基因油条；5：1%转基因面包；6：京花1号小麦；7：市售方便面。扩增目的片断大小314bp。2.4.2Ubiquitin基因特异性的鉴定：因为ubiquitin基因是玉米泛素内源基因，为了进一步确定ubiquitin基因特异性，针对非转基因小麦京花1号、转基因小麦B73、大麦、荞麦、燕麦片、米粉、豆粉、黄玉米、粘玉米、亚麻作物我们进行了PCR特异性实验。凝胶电泳分析结果表明，除了转基因小麦（B73），黄玉米和粘玉米出现目的基因扩增外（314bp），其它作物和空白对照中没有扩增出目的片断（图5）。123456789101112123456789101112图5UbiquitinPCR扩增结果：1:水空白对照,2:大麦,3:荞麦,4:燕麦片,5:京花1号小麦,6:B73,7:米粉,8:豆粉,9:黄玉迷,10;粘玉米,11;亚麻,12;DL2000。扩增目的片断大小314bp。图5UbiquitinPCR扩增结果：1:水空白对照,2:大麦,3:荞麦,4:燕麦片,5:京花1号小麦,6:B73,7:米粉,8:豆粉,9:黄玉迷,10;粘玉米,11;亚麻,12;DL2000。扩增目的片断大小314bp。250bp500bp2.5小麦及其制品外源bar基因的检测针对转基因小麦中bar基因的序列设计了175bp长度的一对引物，对0.1%转基因小麦粉、1%转基因油条、1%转基因面包和非转基因小麦京花1号的总DNA样品进行PCR扩增，得到预期的的结果（图6），并通过实时荧光PCR得到相同结果的扩增曲线。123456123456图6bar基因PCR检测结果1：DL2000；2：1%转基因面包图6bar基因PCR检测结果1：DL2000；2：1%转基因面包；3：1%转基因油条；4：0.1%转基因小麦粉；；5：京花1号小麦；6：水空白对照。扩增目的片断大小175bp。100bp250bp2.6小麦及其制品外源uidA基因的检测针对转基因小麦中uidA基因的序列设计了371bp一对引物对转基因小麦B7、，B102、0.1%转基因小麦粉、1%转基因油条、1%转基因面包和非转基因小麦京花1号的总DNA样品进行PCR扩增。结果是B72、B73、0.1%B73、1%转基因面包和1%转基因油条均得到预期的371bp的PCR扩增片段（图7）。123456789123456789250bp500250bp500bp图7uidA基因PCR检测结果1，9：DL2000；2：0.1%转基因面粉；3：1%转基因油条；4：1%转基因面包；5：B73；6：B72；7：京花1号小麦；8：水空白对照。扩增目的片断大小371bp。2.7普通PCR定性方法检测低限的确定2.7.1bar基因检测低限对转基因小麦和非转基因小麦进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对bar基因（扩增目的片断大小445bp）进行了PCR扩增及凝胶电泳分析（见图8）。结果表明，最低可以检测出0.1%的转基因小麦成分，说明该基因检测低限为0.1%（质量分数）。1234567812345678图8bar基因的最低检测限1：1%B73，2：0.5%B73，3：0.1%B73，4:0.05%B73,5:0.05%B73图8bar基因的最低检测限1：1%B73，2：0.5%B73，3：0.1%B73，4:0.05%B73,5:0.05%B73,6:ck,7:100%B73，8:100bpDNAladdermarker。扩增目的片断大小445bp。100bp500bp2.7.2NOS基因检测低对转基因小麦和非转基因小麦进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对NOS基因（扩增目的片断大小180bp）进行了PCR扩增及凝胶电泳分析（见图9）。结果表明，最低可以检测出0.1%的转基因小麦成分，说明该基因检测低限为0.1%（质量分数）。123456123456图9图9NOS基因的最低检测限1：DL2000；2：1%B73，3：0.1%B73;4：0.05%B73，5：京花1号小麦6：水空白对照；扩增目的片断大小180bp。100100bp250bp2.7.3ubiquitin基因检测低限对转基因小麦和非转基因小麦进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对ubiquitin基因（扩增目的片断大小314bp）进行了PCR扩增及凝胶电泳分析（见图10）。结果表明，最低可以检测出0.1%的转基因小麦成分，说明该基因检测低限为0.1%（质量分数）。1234512345图图10ubiquitin基因的最低检测限1：DL2000；2：水空白对照;3：0.05%B73;4：1%B73;5：0.1%B73。扩增目的片断大小314bp。500bp500bp250bp2.7.4uidA基因检测低对转基因小麦和非转基因小麦进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对uidA基因（扩增目的片断大小371bp）进行了PCR扩增及凝胶电泳分析（见图11）。结果表明，最低可以检测出0.1%的转基因小麦成分，说明该基因检测低限为0.1%（质量分数）。1234512345图11图11uidA基因的最低检测限1：DL2000；2：水空白对照;3：0.05%B73;4：1%B73；5：0.1%B73；扩增目的片断大小371bp。500500bp25250bp2.7.5GAG56D内源基因PCR对非转基因小麦京花1号小麦和非转基因大米进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对GAG56D基因（扩增目的片断大小328bp）进行了PCR扩增及凝胶电泳分析（见图12）。结果表明，最低可以检测出0.05%的转基因小麦成分，说明该基因检测限低限为0.05%（质量分数）。112345500bp250500bp250bp图12GAG56D基因的最低检测限1：水空白对照；2：1%京花1号小麦;3：0.1%京花1号小麦;4：0.05%京花1号小麦;5:DL2000。扩增目的片断大小328bp。2.7.6Wx012对非转基因小麦京花1号小麦和非转基因大米进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对Wx012基因（扩增目的片断大小102bp）进行了PCR扩增及凝胶电泳分析（见图13）。结果表明，最低可以检测出0.1%的转基因小麦成分，说明该基因检测限低限为0.1%（质量分数）。11234100bp图1100bp图13Wx012基因的最低检测限1：1%京花1号小麦;2：0.1%京花1号小麦3：水空白对照；4:DL2000。扩增目的片断大小102bp。250bp3转基因小麦实时荧光PCR定性检测方法的建立3．1实时荧光PCR反应体系的优化实验将引物浓度从0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L梯度递增，探针浓度从0.01umol/L至0.08umol/L以0.1umol/L梯度递增，对引物和探针不同浓度的配比进行了对比实验；将镁离子浓度从1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5umol/L梯度递增；并对Taq酶和dNTP的量进行实验优化。最后对所有反应体系优化实验的结果进行分析比较后，最终确定实时荧光定量PCR反应体系。3．2小麦属内源基因（GAG56D）实时荧光PCR特异性检测实验设计并合成了GAG56D基因的探针和引物，对小麦属中的栽培小麦（染色体组成AABBDD）（转基因小麦B73，非转基因小麦京花1号）；小麦进化中的一粒麦（AA）、二粒麦（AABB）、硬粒麦（AABB）、粗山羊草（DD）、斯卑尔脱小麦（AABBDD）；同时对小麦属以外的大麦，燕麦，荞麦，大豆，玉米，水稻(白米，黑米)，谷子（小米），油菜，亚麻籽等样品，用实时荧光PCR进行了定性检测（见图14）。结果表明，所有小麦属的品种（图14中2-9）中都出现了扩增曲线，而空白对照（图14中1）和其它作物（图14中10-18）中没有扩增曲线。说明在国内外，我们首次筛选出了γ-麦谷醇溶蛋白内源参照基因作为小麦属特有的内参照基因，特异性很好。同时也证明了转基因小麦的DNA提取成功，防止了假阴性结果的出现。图图14GAG56D基因的扩增曲线3.3小麦及其制品内源参照基因蜡质Wx012基因实时荧光PCR特异性检测针对小麦中蜡质内源参照基因Wx012，对转基因小麦（B73，B72，B102，1%B73油条，1%B73面包，市售饼干，婴儿麦粉，方便面，米粉，豆粉），用实时荧光PCR进行了定性检测。结果表明，所有含有小麦成分的小麦及其制品中都出现了扩增曲线，而空白对照和米粉，豆粉中没有扩增曲线（见图15）。结果表明了蜡质内源参照基因Wx012是小麦特有的内参照基因。既证明了小麦的DNA提取成功，又防止了假阴性结果的出现。图15图15Wx012基因的扩增曲线基线上方为B73，B72，B102，1%B73油条，1%B73面包，市售饼干，婴儿麦粉，方便面基线下方空白对照，米粉，豆粉3.4小麦及其制品外源NOS基因实时荧光PCR检测用荧光PCR方法对转基因小麦（B73，B72，B102，1%B73油条，1%B73面包，市售饼干，婴儿麦粉，方便面）的外源NOS基因进行定性检测（见图16），结果表明，转基因小麦（B73，B72，B102，1%B73油条，1%B73面包）出现了外源NOS基因的扩增曲线，而空白对照和市售饼干，婴儿麦粉，方便面，没有出现扩增曲线。图16图16NOS基因的扩增曲线基线上方为B73，B72和B102，1%B73油条，1%B73面包基线下方为市售饼干，婴儿麦粉，方便面，空白对照3.5小麦及其制品外源ubiquitin基因实时荧光PCR检测用荧光PCR方法对转基因小麦（B73，B72，B102，1%B73油条，1%B73面包，市售饼干，婴儿麦粉，方便面）外源Ubiquitin基因进行定性检测（见图17），结果表明转基因小麦（B73，B72，B102，1%B73油条，1%B73面包）出现了外源Ubiquitin基因扩增曲线，而空白对照和市售饼干，婴儿麦粉，方便面没有出现扩增曲线。图17图17ubiquitin基因的扩增曲线基线上方为B73，B72和B102，1%B73油条，1%B73面包基线下方为市售饼干，婴儿麦粉，方便面，空白对照。3.6小麦及其制品外源bar基因实时荧光PCR检测用荧光PCR方法对转基因小麦（B73，B72，B102，1%B73油条，1%B73面包，市售饼干，婴儿麦粉，方便面）品系外源bar基因进行定性检测（见图18），结果表明，转基因小麦（B73，B72，B102，1%B73油条，1%B73面包）出现了外源bar基因的扩增曲线，而空白对照和和市售饼干，婴儿麦粉，方便面没有出现扩增曲线。图18图18bar基因的扩增曲线基线上方从左到右依次为B73，B72和B102，1%B73油条，1%B73面包基线下方为市售饼干，婴儿麦粉，方便面，空白对照。3.7实时荧光PCR定性方法检测低限的确定3.7.1bar基因实时荧光PCR检测低限对转基因小麦和非转基因小麦进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对bar基因进行了实时荧光PCR扩增（见图19）。结果表明，可以检测出0.1%的转基因小麦成分，说明该基因的检测低限为0.1%（质量分数）。图19图19bar基因质量百分比实时荧光PCR检测限扩增曲线基线上方从左到右依次为0.5%B73,0.1%B73基线下方为0.05%B73，水空白对照3.7.2NOS基因实时荧光PCR检测低对转基因小麦和非转基因小麦进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对NOS基因进行了实时荧光PCR扩增（见图20）。结果表明，可以检测出0.1%的转基因小麦成分，说明该基因的检测低限为0.1%（质量分数）。图20图20NOS基因质量百分比实时荧光PCR检测限扩增曲线基线上方从左到右依次为1%b73，0.5%B73，0.1%B73基线下方为水空白对照和0.05%B73。3.7.3Ubiquitin基因实时荧光PCR检测低对转基因小麦和非转基因小麦进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对Ubiquitin基因进行了实时荧光PCR扩增（见图21）。结果表明，可以检测出0.1%的转基因小麦成分，说明该基因的检测低限为0.1%（质量分数）。图21图21Ubiquitin基因质量百分比实时荧光PCR检测限扩增曲线基线上方从左到右依次为0.5%B73，0.1%B73基线下方为水空白对照和0.05%B73。3.7.4GAG56D内源基因实时荧光PCR检测低限的确定对非转基因小麦京花1号和非转基因大米进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对GAG56D基因进行了实时荧光PCR扩增（见图22）。结果表明，可以检测出0.05%的转基因小麦成分，说明该基因的检测低限为0.05%（质量分数）。图22图22GAG56D基因质量百分比实时荧光PCR检测限扩增曲线基线上方从左到右依次为0.5%B73，0.1%B73，0.05%B73基线下方为水空白对照3.7.5Wx012内源基因实时荧光PCR检测低对非转基因小麦京花1号和非转基因大米进行不同重量百分比配比，提取总DNA，对Wx012基因进行了实时荧光PCR扩增（见图23）。结果表明，可以检测出0.1%的转基因小麦成分，说明该基因的检测低限为0.1%（质量分数）。图23图23Wx012基因质量百分比实时荧光PCR检测限扩