转基因成分检测 玉米检测方法

1转基因成分检测玉米检测方法本标准规定了玉米及其加工产品中转基因成分检测的PCR方法和实时荧光PCR方法。本标准的筛选检测适用于玉米及其加工产品中转基因成分的定性检测。本标准的鉴定检测适用于玉米MON810、Btl、Bt76、T14/T25、CBH351、GA21、MON863、Bt10、DP98140、MON87460、MON87427、5307、DAS40278-9品系转基因成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件转基因transgene将物种本身不具有的、宋源间物种的功能DNA序列。通过各种导入手段，使其在该物种中进行表达，以便该物种获得新的品病导征在栽培的物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基国。该基因可用于对基因组中某一目的基因的定量分析。下列缩略语适用于本文件。IVR:玉米的转化酶1基因，内源基因(imvertaseIgenefrommaize)Zein:玉米醇溶蛋白基因，内源基因。CaMV35S:来自花椰菜花叶病毒的35s启动子(35SpomoterfromCaaLflowermosalewins)。CDPK:钙依赖蛋白激酮基因[caleium-dependentpoteinkinase(CDPK)gene]。CgIA(b):苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryLA(b)基因[asyntheticggneencodesthefiret648aminoarids,insecticidal-activefrnuncatedpmduectidenticaltothatofcpyl4(b)geneofBacllastharinglensisCr9C:苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白Cn9C基因(inaecticidal-activefirancatedproductidenticaltothatofCy9CgeneofBacillustharinglensissabsHSP70:[0.8Kbintonfromthehsp70gene(heal-shockprotein)]来自热休克蛋白(hsp70)基因的0.8Kb基因内区。IVS2:玉米乙醇脱氢酶基因的基因内区2(intmonfomthemaizealcoholdehydmgenasegene)。mEPSPS:来源于玉米的葬草酸羟基乙酰转移酶(maize5-enolypyrurylshikimate-3-phosphatNOS:胭脂碱合成酶基因终止子(terminatorofnopalinesynthasegene)。NPTII:新霉素-3°磷酸转移酶基因(neomycin-3'phosphotransferasepene)。OTP:优化运输肽基因(optimizedtramsitpepidegene)。PactinI:来源于玉米肌动蛋白1基因的启动子[thepromoterderivedfromtherice(Orzasatia)PAT:草丁脾乙酰转移酮基因(phosphinothricinacetyltransferasegene)。Tay:水生热栖菌(Thermasaywaticw)。a值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(C:Cycle,t:threshold)。4防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行5抽样和制样按照GB/T19495.7中规定的方法执行。称取约50g玉米样品，经干热灭菌(150℃干热预处理2h)或120℃、30mim高压消毒处理的碾钵或粉碎机中碾磨至样品粉末颗粒约0.5mm大小。样品经过提取DNA后，针对转基因植物所插人的外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增外源基因的DNA片断，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有转基因成分。6.2试剂和材料除另有规定外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB6682规定的一级水。6.2.1引物：检测转基因玉米内、外源基因的引物及其信息见附录A。62.5溴化乙锭(EB)或其他染色剂。6.2.11CTAB裂解液：3%CTAB(质量浓度),1.4mol/LNaCl,02%(体积分数)随基乙醇，20mmolL.EDTA,100mmolLTris-HCl,62.12TE缓冲液：10mmolVLTis-HC,pH8.0;1mmolLEDTA,pH8.0。HCI(pH88)。1%TimnX-100,1mg/6.2.145×TBE缓冲液：Tris54g,硼酸275g,0.5mol/LEDTA(pH80)20mL,加蒸馏水至1000mL。6.2.1510×上样缓冲液：025%溴酚蓝，40%蓝糖。6.3.1固体粉碎机及研钵6.32高速冷冻离心机6.3.3台式小型离心机6.3.4Mimi个人离心机6.3.6纯水器或双蒸水器6.3.9核酸蛋白分析仅6.310凝胶成像系统。6.3.11微量移液器(0.1μL~2μl、0.5μL~10μL、2μL~20μL、10检测过程中应按照GB/T19495.2中的规定设置对照阴性目标DNA对照：不含外源目标核酸序列的DNA片段。阳性目标DNA对照：参照DNA,或从可溯源的标准物质提取的DNA,或从含有已知序列阳性样品(或生物)中提取的DNA。扩增试剂对照：该对照包括除了测试样品DNA模板以外所有的反应试剂，在PCR反应体系中用相同体积的水(不含核酸)取代模板DNA。称取1g粉样于10mL离心管中，加入5mLCTAB裂解液(含适量RNA酶),混匀，60℃水浴振荡保温1h,2000rmin离心5min;取上清液，加等体积三氯甲烷/异戊醇(体积比：24/1)混匀，静置5min,8000fmin离心5min;小心取离心上清液。再加等体积三氯甲烷/异戊醇(体积比：24/1)混匀，静置5min,8.000thmin离心5min;取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇，混匀，12000r/min4℃离心10min;弃上清液，加500μL70%冰乙醇洗涤一次，12000rpm4℃离心5min;弃上清。将沉淀晾干，加入50pLTE,溶解沉淀(4℃过夜，或37℃保温1hr)。此即为总DNA提取液。也可用相应市售DNA提取试剂盒提取DNA,或参照GB/T19495.3执行。PCR反应体系见表1,每个样品各做两个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全落入反应液中，不要粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖表1PCR反应体系dMIP(含dUIP)50℃PCR前去污染2min,94℃预变性2min。94℃变性40s,55℃~58℃退火60s,72℃延伸60s,35个循环，72℃延伸5min,4℃保存。也可根据不同的基因扩增仪对PCR反应循环参数做适当调整56.4.4PCR扩增产物电泳检测用电泳缓冲液(1×TBE或TAE)制备2%琼脂糖凝胶(其中在55℃-60℃左右加人EB或其他染色剂至终浓度为0.5μg/mL,也可在电泳后进行染色)。将10μL~15μLPCR扩增产物分别和2pL上样缓冲液混合，进行点样。用100bpLadderDNAMarker或相应合适的DNAMarker作分子量标记。3Vem-5Vem恒压，电泳20min~40min。凝胶成像仪观察并分析记录。6.5结果判断6.5.1内源基因的检测用针对玉米内源基因IVB基因(或Zcin基因)设计的引物对玉米DNA提取液进行PCR测试，待测样品应被扩增出226bp(或173bp)的PCR产物。如未见有该PCR产物扩增，则说明DNA提取质量有问题，或DNA提取液中有抑制PCH反应的因子存在，应重新提取DNA,直到扩增出该PCRI产物。6.5.2外源基因的检测对玉米样品DNA提取液进行外源基因的PCR测试，如果阴性目标DNA对照和扩增试剂对照未出现扩谱条带，阳性目标DNA对照和待测样品均出现顶期大小的扩增条带(扩增片段大小见附录A中的表A.1),则可初步判定待测样品中含有可疑的该外源基因，应进一步进行确证试验(见6.6),依据确证试验的结果最终报告；如果待测样品中未出现PCR扩增产物，则可断定该待测样品中不含有该外源基因。6.5.3筛选检测和鉴定检测的选择对玉米样品中转基因成分的检测按照附录A执行，先筛选检测CaMV35S、NOS、NPTII、PAT、若筛选检测结果阳性，则需进一步鉴定检测MON810、BtI、Be176、T14/T25、CBH351、GA21、TC1507、MON863、NK603、Br10的结构特异性基因或品系特异性基因，以确定是何种转基因玉米品系。实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对检测模板进行定性分析的方法7.2主要仪器实时荧光定量PCR仪；核涡酸蛋白分析仪；高速冷冻离心机、台式小型离心机、Mini个人离心机；纯水器或双蒸水器；旋涡振荡器；微量进样器(0.5μL,2μL,10μL。20μt,100μL,200μL.1000μL);离心管：1.5mL-5mL;实时荧光PCR反应管。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6实验用水：应符合GB6682中一级水的规格；PCR缓冲液；MgCl,;dNTPsdATP、dTTP、dCTP、引物和探针：玉米转基因成分实时荧光PCR检测所用引物和探针序列见附录A表A.2。7.4.1对照的设置7.4.3实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表2、表3(可根据实际需要任选其一),每个样品各做两个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全落入反应液中，不要粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。551111UNG酶(1UhuL)上游引物(10pmo/L)1下游引物(10μmlL)1探针(5pmol/L)17ag酶(5UWL)DNA模板(40ngjuL-50ngjpL)5TaqMamRRUmiveosalPCRMasterMix(2x)上游引物(10μmol/L)7探针(5μmol/L.DNA模板(40nghuL-50nguL)注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量，也可根据具体情况7.4.4实时荧光PCR反应参数实时荧光定量PCR的反应参数为：50℃PCR前去污染2min;预变性95℃10min;95℃15s,60℃1min,45个循环。7.4.5仪器检测通道的选择PCR反应管荧光信号收集的设置，应与探针所标记的报告基团一致。报告基团为FAM时，荧光信号收集应设在FAM通道：报告基团为TET时，荧光信号收集应设在TET通道；以此类推。具体设置方法因仪器而异，可参照仪器使用说明书7.4.6实时荧光PCR反应运行按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放(上机前应注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器).开始运行仪器进行实时荧光PCR反应。7.4.7结果分析实时荧光PCR反应结束并分析结果后，应设置无效基线范围。无论采用任何荧光通道(FAM或TET),基线范围选择在315个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阀值设置原则以基线刚好超过4阴性4标DNA对照扩增曲线的最高点，且Cr值等于40为准。7.4.7.2Ct值与DNA浓度的关系Ca值大于或等于40时，PCR过程中无目标DNA的扩增；a值在36至40之间，且平行样的每个值之间的差异很大，表明PCR反应体系中的目标DNA量很少，应适当增加模板量。7.5实时荧光PCR检测的质量控制扩增试剂对照：外源基因检测C值大于或等于40。内源基因检测C值大于或等于40。阴性目标DNA对照：外源基因检测a值大于或等于40。阳性目标DNA对照：外源基因检测C值小于或等于36。上述指标有一项不符合者，应重做实时荧光PCR扩增。7.6筛选检测和鉴定检测的选择对玉米样品中转基因成分的检测，可参考附录B的内容，先筛选检测CaMV35S、NOS、NPTI、PAT、BAR、CrIA(b)基因，筛选检测结果阴性则直接报告结果。8若筛选检测结果阳性，则需进一步鉴定检测MON810、Bt1、B1176、T14/T25、CBH351、GA21、ES3272、Bt10、DP98140、MON87460、MON87427、5307、DAS40278-9品系特异性基因，以确定是何种转基因玉米品系。7.7结果判断待测样品外源基因检测Ca值大于或等于40,内源基因检测C值小于或等于28,设置的对照结果正常者，则可判定该样品未检出xxx基因；待测样品外源基因检测ca值小于或等于36,内源基因检测C值小于或等于28,设置的对照结果正常者，则可判定该样品检出xx×基因；待测样品外源基因检测Cr值在36~40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40,且设置的对照结果正常，则可判定该样品检出×××基因；再次扩增后结果Ci值大于40。且设置的对照结果正常，可判定该样品未检出xx×基因。8结果表述8.2检出xxx基因，(可进一步报告)该样品中含有xx××转基因玉米品系内源5'-cgigtalcaeaaprtgp任选其一内源基因5°-gatmitgnata-3”筛选检测任选其一-ttateetagttgrpgrta-3”任选其一品系5°-ctcpaappccetiost5°-lctrgsltiltggectl5°-aegtggaugigtlont5”-gactcaagiootgpog5°-atgutgicctiegngtaateii5°-aapapatateaggaloacteaa5"-cacarzopatlatLatapod5'标记FAM:3'标记TAMRA或blips(内源基因)(内源基因)5°-egegtieccactetleetee-3”5°-alegtteiscattgga-3”5”-cgrtragtggarguaartr-3”5°-cgllotggpaaggstagiatrgc-3”S'-ocpagepeapgscepr任选其一125品系5“-dtategtalptalltpsaar5°-lgstc