饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的定性检测 实时荧光PCR法 编制说明

定性检测实时荧光PCR法》（征求意见稿） 1 1 1 1 5 6 7 7 7 8 8 9 9 11 2.3.8绝对检测限（Absolutelimitofdetection)测试 2.3.9相对检测限（Relativelimitofdetection)测试 2.3.10方法的稳健性（Robust 32 32 33 1根据《国家标准化管理委员会关于下达2023年国家标准复审修订计划的通疯牛病(BSE)是发生在成年牛的一种慢性进行性高致死性神经系统疾病，属表1我国主要动物源性成分检测标准汇总饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法荧光PCR法荧光PCR法2荧光PCR法转基因动物及其产品成分检测普通牛(Bostaurus)内标准基因定性黄羊源性成分检测实时荧光PCR法牛和山羊源性成分同步检测方法实时荧光PCR法牛和马源性成分同步检测方法实时荧光PCR法牛和猪源性成分同步检测方法实时荧光PCR法马源性成分检测方法实时荧光PCR法绵羊和山羊源性成分同步检测方法实时荧光PCR法饲料中羊源性成分检测方法（荧光定量PCR法）羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法食品中马、驴源性成分定性检测方法实时荧光PCR法食品中鸡、鸭源性成分定性检测方法实时荧光PCR法料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法》。但该标准存3山羊完全配对，与绵羊相差7个碱基，会导致绵羊成分漏检。上海口岸在2003年曾经发现SN/T1119-2002标准的严重缺陷，重新设计绵羊的引物，连续从价在海关日常的进口饲料检测中，检测人员使用检验检疫行业标准《SN/T2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》检测出牛羊成分出现阳性结果需要退货或销毁时，客户会提出使用国家标准GB/T1Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbmethod分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR检42Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR3Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part3Porcmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR4Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part4ChickenDNAdemethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR5Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR6Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR7Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part7Donkeymethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR8Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR检测方法第8部分—火鸡DNA检测方法9Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCRMolecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCRMolecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Parmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR本项目修改采用建议参照ISO/TS20224-1:2020、ISO/TS20224-2:2020、5产品的质量安全，促进我国饲料工业、畜牧业和水光PCR法》制定任务后，对该标准的具体工作进行了认真研究，确定了总体工6 2024年6月，标准编制小组完成标准文本、编制说明定向征求意见稿编制7该标准在具有质量控制及检验水平的分子生物学实验内可以使用便于检测该检测方法的相对检测下限为0.1%（W/W)，绝对检测下限均为5拷贝参考ISO/TS20224-1:2020《分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成2020《分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR检测方法第2部分—绵羊DNA检测方法》、ISO/TS20224-5:2020《分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR检测方法第5部分—山羊8DNA检测方法》，开展方法学研究，建立了《饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的定性检测实时荧光PCR法》。DNA提取试剂或DNA提取试剂盒、荧光定量PCR扩增实验配套试剂、蛋条引物配制成400nmol/L储存液，将每条引物探针配制成200nmol/L储存液，表3引物探针序列目标物种引物探针编号序列基因序列号18SrRNA参照方法118S-137bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’XR_003508809.118S-137bp-R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’18S-137bp-P5’-[FAM]-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-[TAMRA]-3’真核生物18SrRNA参照方法218S-136bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATG-3’18S-136bp-R5’-ATTTGCGCGCCTGCTG-3’18S-136bp-P5’-[FAM]-TGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGC-[TAMRA]-3’18SrRNA参照方法318S-179bp-F5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3’18S-179bp-R5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3’18S-179bp-P5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’18SrRNA参照方法418S-159bp-F5’-TACCCCAGGGATAACAGCGC-3’18S-159bp-R5’-TCCGGTCTGAACTCAGATCACG-3’18S-159bp-P5’-[FAM]-TGTTAATCGTTGAACAAACGA-[MGB]-3’牛Bov-62bp-FF:5′-GGCCTCGGAGTGTGTATTCAG-3′NC_037352.1Bov-62bp-RR:5′-GCCCCAGAATGAGGTTCACTT-3′Bov-62bp-PP:5′-[FAM]-AGGTGCACAGTACGTTC-[NFQ-MGB]-3′绵羊Ovine-88bp-F5’-CCAACATGCCTTTAAACCCTCAA-3’AF041979.1Ovine-88bp-R5’-GGAACTGTAGCCTTCTGACTCG-3’Ovine-88bp-P5’-[FAM]-TGCCTTTCCTTCCCCGCCAGTCTC-[TAMRA]-3’Goat-87bp-F5’-GGAAGGAAAGAGAATGGGGATATGG-3’NC_030816.1Goat-87bp-R5’-TCTCCACACACAGCCAAAACC-3’Goat-87bp-P5’-[FAM]-ATCCATCTCTCCCTCCACTCCCTGCCTAA-[TAMRA]-3’9定仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Eppendorf5425小型台式高速离心机（德国Eppendorf公司）；UFE500AO型烘箱（德国Memeert公司）；SPEX6850型冷冻碾磨机（美国SPEXSamplePrep公司）；QX1）；国产精补饲料阳性样品的制备：使用犊牛精料补充料，分别添加5%含量的国产浓缩饲料阳性样品的制备：使用种猪浓缩饲料，分别添加5%含量的牛国产配合饲料阳性样品的制备：使用对虾配合饲料，分别添加5%含量的牛为了保持检测结果的一致性和提取方法的简便性，本研究所用的DNA提取方法，除比较核酸提取方法1和核酸提取方法2的效果外，均采用核酸提取方法2表4PCR实验反应体系—表5PCR反应程序反应温度反应时间循环数预变性95℃10mins1热循环（扩增）95℃4060℃通过检测内参基因真核生物18SrRNA基因，可以判断样品所提取的DNA是否适合于PCR扩增。但目前关于18SrRNA基因检测，空白对照出现扩增曲实验样品包括：18种动物肉类、3种植物种子、3种细菌（原核生物），表618SrRNA检测实验样品1鸽23马4驴5螺678鸡9猪鹅鸭猫鹿狗阴性对照（细菌）、空白对照（水）也会出现扩增，检测Ct值区域见表7。表7四套引物和探针检测Ct区域比较1234使用18S-179bp-F/18S-179bp-R/18S-179bp-P引物和探针进行检测，在样品之间，阴性对照（金葡球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等原核生物）和空白对照在表8检测18SrRNA各样品的Ct值Ct值样品123456789均值1普通牛21.1021.1220.3421.0320.1520.8721.1721.0920.3320.3420.752美洲野牛20.2120.2421.0821.1220.3421.0420.2120.1920.4821.3320.623马20.7620.2320.7820.2721.0121.2620.5620.7821.6521.4220.874驴19.0119.8819.5620.0120.3919.1819.7520.3319.8419.0719.705螺19.1219.8319.3220.2119.8720.4720.1919.5620.1419.3919.816绵羊20.1619.9920.2220.2919.6719.8820.5620.3920.9820.6920.28718.4819.3418.7619.0118.7319.5220.3319.8718.2718.3819.078鸡21.9720.8821.2420.8621.3321.0522.3420.7721.0821.7621.339猪22.3522.3421.8922.7821.0922.1721.3922.7722.2922.0322.11鹅20.7119.3920.4420.2820.7820.2221.0119.5620.4920.3820.33鸭18.8219.0128.9819.3218.7318.5219.2218.5919.3319.3619.99猫24.9522.0523.7723.6223.7422.8524.2723.6223.6523.3223.58火鸡20.3621.2221.3220.1821.2420.3120.4320.5421.0820.0820.68鹿21.2322.2221.1721.3122.0821.8322.0822.7921.0622.3321.81骆驼20.7120.3921.1621.3820.6620.3920.0621.3321.5620.0320.77狗19.3619.9920.2119.8320.1720.6920.3319.0620.3519.7819.78鸽19.7120.3120.7719.7319.7719.3620.0120.0319.7919.3819.89大鼠18.9819.9819.0318.8818.3218.7519.0319.2218.7318.9618.99玉米13.6913.7513.4414.2113.9913.2413.6414.2213.6913.7313.7620大豆14.5513.9913.7614.2214.3514.5214.2913.6614.8914.7214.3021苜蓿14.0114.6513.5714.4314.0913.7714.8214.8813.7914.0314.2022猪皮明胶31.7630.7731.2532.0831.4431.0531.3732.1432.3331.8431.6023明胶药壳28.8728.6729.3228.3529.4529.8829.0328.0728.4928.7828.8924牛奶巧克力24.9325.7124.9925.3225.4824.8924.7725.4125.1325.3925.2025豆粉花生24.7725.3824.9624.7935.2725.3324.8424.3125.0325.4426.0126芥末南瓜籽25.8125.4425.7926.0425.4126.1225.8825.9225.4725.9625.7827曲奇饼干20.8120.0820.1220.1720.9820.7821.9121.3321.4921.0620.8728牛奶粉32.0332.3932.1732.3932.3332.1733.4533.1332.0932.8432.4929羊奶粉32.7933.4132.0533.1832.5832.1133.0932.4832.6232.7732.7130NegativeControl(金葡球菌)38.6240.5238.9939.3240.7741.0739.3838.7938.2240.6339.6331NegativeControl(沙门氏菌)37.6538.9538.7739.0337.7237.8838.6939.4138.0537.2138.3432NegativeControl(大肠杆菌)39.4739.7739.5340.7341.0839.4438.7839.6939.8839.0639.7433BlankControlO)40.1940.7740.1737.1537.7540.0741.0138.6239.2437.5139.25（2）本研究使用上海生工生物工程公司、大连宝生物、华大基因、上海英骏生物技术有限公司、ThermoFisherScientific（3）本研究将上海生工生物工程公司合成的引物和探针干粉直接寄至上海本项目在深入研究的基础上，分析其原因可能是：TaqDNA聚合酶（Taq），物探针组对样品进行检测，每个浓度设置6个重复，PCR反应体系与反应程序表9样品DNA稀释浓度及对应Ct值123456利用数字PCR对梯度稀释的样品DNA进行检测结果显示，该结果同实时荧光PCR实验的结果保持一致，说明有效区分阳表10数字PCR反应体系PCR反应总体积样品4正/反引物探针0.5PCR扩增酶混合物水表11样品浓度与拷贝数12345622注释:“---”超出检测线性范围拷贝数明显高于牛细胞，前者高于后者60倍左右。taurus)、印度瘤牛(Bosindicus)、美洲野牛Bison(Bisonb检测结果为阳性；使用绵羊的检测方法检测时，绵羊(Ovisaries)的检测结果为阳性，使用山羊的检测方法检测时，山羊(Caprahirc表1218SrRNA、牛、绵羊、山羊检测方法特异性测试物种种类动物普通牛(Bostaurus)++--印度瘤牛(Bosindicus)++--美洲野牛(Bisonbison)++--牦牛(Bosmutus)++--绵羊(Ovisaries)+-+-山羊(Caprahircus)+--+骆驼(Camelusbactrianus)+---鲤鱼(Cyprinuscarpio)+---猫(Feliscatus)+---鸡(Gallusgallus)+---狗(Canisfamiliaris)+---驴(Equusasinus)+---鸭(Anasplatyrhynchos)+---麋鹿(Cervuscanadensis)+---金鱼(Carassiusauratus)+---鹅(Anseranser)+---马(Equuscaballus)+---小鼠(Musmusculus)+---恒河猴(Macacamulata)+- -鸵鸟(Struthiocamelus)+---野鸡(Phasianuscolchicus)+---猪(Susscrofadomesticus)+---野猪(Susscrofa)+---鸽(Columbalivia)+---鹌鹑(Coturnixcoturnix)+---兔(Oryctolaguscuniculus)+ -大鼠(Ratusnorvegicus)+---虹鳟鱼(Onchorhynchusmykiss)+---火鸡(Meleagrisgallopavo)+- -水牛(Bubalusbubalis)+---人(Homosapiens)+---植物苜蓿(Medicagosativa)+- -玉米(Zeamays)+---油菜(Brassicarapa)+---大米(Oryzasativa)+---高粱(Sorghumbicolor)+- -大豆(Glycinemax)+---小麦(Triticumaestivum)+---2.3.8绝对检测限（Absolut术对克隆质粒的拷贝数进行精确定量检测，准确稀释到1000拷贝/μL。将定量测方法进行检测，结果显示所建立的牛、绵羊、山羊成分PCR检测方法在DNA浓度为1拷贝/µL（5拷贝/PCR反应）时都能1说明所建立的牛、绵羊、山羊成分PCR检测方法的绝对检测限可达5拷贝/PCR表13牛、绵羊、山羊检测方法的绝对检测限测试牛DNA浓度/（拷贝/μL）靶序列拷贝数/（拷贝/PCR反阳性结果百分比（%)贝/μL）贝数/（拷贝/PCR反阳性结果百分（%)DNA浓度/（拷贝/μL）贝数/（拷贝/PCR反应）阳性结果百分比（%)4442221515152221112.3.9相对检测限（Relativ20表14牛、绵羊、山羊检测方法的相对检测限测试牛质量百分比阳性结果百分比(%)质量百分比阳性结果百分比(%)质量百分比阳性结果百分比(%)5.05.05.02.02.02.00.0150.0%0.0141.7%0.0133.3%0.0010%0.0010.0%0.0010%使用牛、绵羊、山羊PCR成分检测方法进行检测，结果显示所建立的牛、绵羊、），表15牛、绵羊、山羊检测方法的相对检测限测试牛质量百分比阳性结果百分比(%)质量百分比阳性结果百分比(%)质量百分比阳性结果百分比(%)5.05.05.02.02.02.00.0125.0%0.0150.0%0.0141.7%210.0010%0.0010.0%0.0010%表16不同仪器型号对测试结果的影响仪器型号牛ABI7500+++BioRadCFX96+++ABI7900HTFast+++EppendorfRealplex4+++表17不同反应体积对测试结果的影响反应体积(µL）牛+++20+++21+++本项目用了三种不同的退火温度（59、60、61℃)分别对牛、绵羊、山羊表18不同退火温度对测试结果的影响退火温度(℃)牛2259+++60+++61+++表19不同引物探针浓度对测试结果的影响引物探针工作液浓度(μmol/L）加样体积(μL）牛上游引物1+++上游引物1探针0.5上游引物0.85+++上游引物0.85探针0.425上游引物0.7+++上游引物0.7探针0.35以上实验结果证明，所建立的牛、绵羊、山分检测，结果如表20所示，表明这些方法适23表20实际饲料样品的检测牛1 234 56 78924 12 25 料 料 26 用修订前标准的方法，未检测出绵羊成分（见表21）。表21修订后标准和修订前标准检测结果比较样品检测项目本方法GB/T20190-2006是否一致种猪浓缩饲料+5%含量的牛肉骨粉牛源性成分++一致种猪浓缩饲料+5%含量的绵羊肉骨粉绵羊源性成分+-不一致种猪浓缩饲料+5%含量的山羊肉骨粉山羊源性成分++一致种猪浓缩饲料+1%含量的牛肉骨粉牛源性成分++一致种猪浓缩饲料+1%含量的绵羊肉骨粉绵羊源性成分+-不一致种猪浓缩饲料+1%含量的山羊肉骨粉山羊源性成分++一致2.6不同DNA提取方法对检测结果的影响比较5%含量的牛肉骨粉、5%含量的绵羊肉骨粉、5%含量的山羊肉骨粉、1%含量的27表22不同DNA提取方法对检测结果的影响比较序号名称牛DNA提取DNA提取DNA提取DNA提取DNA提取DNA提取1种猪浓缩饲料+5%含量的牛肉骨粉2种猪浓缩饲料+5%含量的绵羊肉骨粉3种猪浓缩饲料+5%含量的山羊肉骨粉4种猪浓缩饲料+1%含量的牛肉骨粉5种猪浓缩饲料+1%含量的绵羊肉骨粉6种猪浓缩饲料+1%含量的山羊肉骨粉来西亚、美国、葡萄牙、中国在内的6个国家分两次进行国际协同实验，12个表23假阳性、假阴性率测试样品牛28参加协同实验的实验室数量提交结果的实验室数量每个实验室收到的样品数量总样品数量含有检测靶序列的样品数量787872不含检测靶序列的样品数量787872假阳性结果的数量000假阳性率/%000假阴性结果的数量000假阴性率/%000LOD和POD验证：通过协同实验统计结果表明，样品浓度在1copy表24绝对检测限的协同实验结果分析牛靶序列拷贝数（拷贝/PCR反应）P/TP(%)P/TP(%)P/TP(%)2078/7878/7872/7278/7878/7872/72578/7878/7872/72269/7888.573/7893.664/7288.9145/7847.750/7864.151/7270.80.527/7834.632/7841.033/7245.80.18/787/789.08/72表25检出概率（POD）的协同实验结果29参数牛绵羊实验室数量每个稀释水平的PCR重复数量666实验室间平均POD0.770,790.82实验室间平均POD的95%置信区间0.66-0.860.69-0.880.71-0.90相对于理想POD曲线（b=1）的斜率b实验室间相对标准偏差σL0.300.300.30理论中位数实验室的LOD95%（以拷贝/PCR反应表示）3.23.22024年6月，标准编制小组委托国家食品质量检验检测中心（上海）、四川30表26国内外实验室之间的样品检测结果比对（牛成分检测方法）Bovine-62bp-F/Bovine-62bp-R/Bovine-62b号1-++-+-++--+-2-++-+-++--+-3-++-+-++--+-4-++-+-++--+-5-++-+-++--+-6-++-+-++--+-7-++-+-++--+-8-++-+-++--+-9-++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+-结果结果结果结果结果结果结果结果结果结果结果结果为了验证绵羊成分检测方法的检测数据对比情况，通过国际协同实验，向表27国内外实验室之间的样品检测结果比对（绵羊成分检测方法）Ovine-88bp-F/Ovine-88bp-R/Ovin号1+-+-++--+--+2+-+-++--+--+3+-+-++--+--+4+-+-++--+--+315+-+-++--+--+6+-+-++--+--+7+-+-++--+--+8+-+-++--+--+9+-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--+为了验证山羊成分检测方法的检测数据对比情况，通过国际协同实验，向），表28国内外实验室之间的样品检测结果比对（山羊成分检测方法）Goat-87bp-F/Goat-87bp-R/Goat-号1+-+-+-+-+-+-2+-+-+-+-+-+-3+-+-+-+-+-+-4+-+-+-+-+-+-5+-+-+-+-+-+-6+-+-+-+-+-+-7+-+-+-+-+-+-8+-+-+-+-+-+-9+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-32本项目修改采用ISO/TS20224-1:2020、ISO/TS20224-2:2020、ISO/TSfBovineDNAdetectionmethod分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实MolecularbiomarkerfOvineDNAdetectionmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实Molecularbiomarkfanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsDNAdetectionmethod.分子生物标33（2）发布后、实施前应将信息在媒体上广为宣传，建议全国饲料工业标准34[2]国家质量监督检验检疫总局.饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应(PCR)法:GB/T[3]国家质量监督检验检疫总局.明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法:GB/T[4]国家质量监督检验检疫总局.动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛,羊,鹿)定性检测方法PCR方法:[5]国家质量监督检验检疫总局.食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法:SN/T[6]国家质量监督检验检疫总局.动物产品中牛、山羊和绵羊源性成[9]中华人民共和国农业部.转基因动物及其产品成分检[10]中华人民共和国工业和信息化部.肉类罐头中牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分检测方法PCR法:QB/T[12]中华人民共和国海关总署.出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第7部分:绵羊成分检测[16]国家质量监督检验检疫总局.动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法:SN/T2978—2011[S].北京:[17]国家质量监督检验检疫总局.动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法PCR方法:GB/T[18]国家质量监督检验检疫总局.食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第5部分:马成分检测实时荧35[19]国家质量监督检验检疫总局.食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第4部分:驴成分检测实时荧[21]中华人民共和国海关总署.出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第12部分:火鸡成分检测[23]ISO.Molecularbiomarkeranalysis—Detectreal-timePCR—Part1BovineDNAdetectionmethod:ISO[24]ISO.Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimalderivedmatreal-timeP