β-内酰胺类抗生素高分子杂质测定法课件

β-内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第一节β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质一

、定义β-内酰胺类抗生素(β-lactam

antibiotics)系指

化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，包括

临床最常用的青霉素(penicillins)与头孢菌素(cephalosporin),

以及近年开发的头霉素类、

硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺

类抗生素。系对药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。

其分子量一般在1000～5000,个别可至约10000道尔顿，小于化工、生化领域中所指的高分子化合物

2018的分子量。β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质必二、分类及来源按其来源分为两类：外源性杂质和内源性杂质。外源性杂质：包括蛋白、多

肽、多糖等类

杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合

物。一般来源于发酵工艺，如青霉素中的青

霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。2018/9/6内

源性杂质：抗菌药物自身聚合产物。聚合物即可来自生产过程，又可在储存中形成，

甚至在用药时使用不当也可产生。抗生素聚合物的免疫原性通常较弱，但作为

多价半抗原，可引发速发型过敏反应。片

云

士

A

.

么

H

上

一

山随着现代生产工艺的不断改进和提高，冒前产品中外源性杂质日趋减少，对内源性聚合

物的控制是当前抗生素药物高分子杂质控制的重点。+载体(carrier)→完全抗原。图1

水温引起阿莫西林干糖浆中高分子杂质含量的变化2018/9/65β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质三、形成机理及结构特征(

一)青霉类抗生素：高分子杂质有蛋白(多肽)

类杂质和聚合物杂质两大类。2018/9/6青霉噻唑多肽：制剂中的青霉噻唑多肽的分子量主要分布在3500～2400道尔顿左右，有青霉素的β-内酰

胺环和多肽的伯氨基按亲核反应机理缩合而

成，主要发生在发酵工艺中。样品在储存过

程中，多肽类杂质残留的自由氨基仍与β-内

酰胺反应，直至被饱和，反应速度和样品本

身的水分含量及储存温度有关。2018/9/6NH7多肽碎片青霉噻唑蛋白的基本结构2018/9/6C-(H,

一C

NH青霉素G5

CHNCH(TKHSHH内酰胺环断裂点CH3CH3

C00HR——C0—HH—CHCO8青霉素聚合物：1.反应仅和母核结构有关，侧链中的活性基团不参与反应。一分子青霉素首先开环，形成一新的活性位点，并与另一分子青霉素聚合。2.侧链参与的聚合反应主要以氨苄青霉素为代表，反应时侧链上的氨基亲核攻击β-内酰胺抗生素的羰基碳原

子，形成聚合物。2018/9/6头孢菌素：头孢菌素中的高分子杂质主要是

不同类型的聚合物。1.只与母核结构有关的N型聚合反应eg.头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等2.侧链参与的L型聚合反应。eg.

头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等

在碱性条件下，两种反应都可以发生。2018/9/6

10β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质四、结构特点高度的不均一性和不确定性。1.青霉噻唑多肽(蛋白)类杂质发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片都可能带入到产品中；相同的蛋白或蛋白碎片上可

以结合不同数目的药物分子。2018/9/6

11β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质五、影响聚合物形成的因素1.青霉素的聚合物青霉素的聚合反应速度在溶液条件下和溶液的酸碱度关系密切；在固体条件下主要和

样品的水分含量有关。2018/9/6

132.头孢菌素的聚合物固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含水量和贮存温度的关系密切。贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度

上升至37℃时，含水量差异对聚合物含量的

影响十分显著。2018/9/6β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质六、口服青霉素类药物使用前进行皮试的必

要性口服青霉素类抗生素在国内外均有过敏反应报道，但其原因未有试验报道。有相关报

道，在青霉素V

聚合物可经胃肠道吸收而引

发过敏反应。因此，在口服青霉素类抗生素

前，必须进行皮肤过敏试验，这是十分必要

的。2018/9/6

15β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质七、抗生素高分子杂质的质控意义1.

β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质是引发

临床速发型过敏反应的过敏原；2.高分子杂质经注射和口服都可引起过敏反

应，因此注射剂和口服剂都应控制。3.高分子杂质是β-内酰胺类抗生素质量评价

的重要指标，可评价药品质量和稳定性，并

可借此进一步评价其生产工艺。2018/9/6

16第二节

高分子杂质分析方法一、概述高分子杂质质控方法化学分析

免疫学分析色谱法

分光法(P

值法)

间接血凝法

豚鼠PCA法反相模式

离子交换模式

凝胶色谱模式2018/9/6

17由于结构不同的高分子杂质通常有相似的生

物学特性，如：均为过敏性杂质，因此，在

药物质量控制中一般不需分别控制不同结构

的高分子杂质含量，而只需控制药品中高分

子杂质的总量。故根据分子量差异进行分离

的凝胶色谱模式是简便易行的分离模式。以葡聚糖凝胶Sephadex

G-10为基础的凝胶

色谱分析方法，可简便地用于对各种β-内酰

胺类抗生素中的高分子杂质的分离、分析，并满足药品质量控制的需要。2018/9/6

18二

、凝胶色谱系统的分离原理及特点2018/9/6

19高分子杂质分析方法凝胶色谱系统的分离原理及特点1.凝胶色谱法凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色

谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分

析以及相对分子质量分布测试。凝胶色谱法

又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来

的一种快速而又简单的分离分析技术，由于

设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对

高分子物质有很高的分离效果。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻

01滞作用也不同而进行分离、分析的方法。

20凝胶色谱系统的分离原理及特点2.

凝胶色谱系统的分离原理(1)利用凝胶色谱的分子筛机制，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，

一般为几百至几千

埃。让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而

所有的高分子杂质被排阻，进而实现让所有

高分子杂质具有相同的保留时间的设想。2018/9/621凝胶渗透色谱按分子大小分离原理图2018/9/6样品混合物样品分离分离完全分离后样品离开

分离柱22凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状

结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化

合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则

不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav

(被分离化合物在内

水和外水体积中的比例关系)表示。2018/9/6

23实验证明，

Sephadex

G-10凝胶可基本保证所有的β-内酰胺抗生素中的高分子杂质被

排阻。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Kav:

分配系数；Ve:

被分离物质洗脱体积；Vo:

柱内凝胶床中颗粒间自由空间所占有的体积(外水体积);Vt:

柱内凝胶颗粒占有的体积与外水体积之和

(柱床体积)2018/9般Kav≈0洗脱的组分视作高分子杂质。

24外水体积

(Vo)

:

凝胶柱中凝胶颗粒周

围空间的体积，即液体流动相体积；内水体积(Vi)

:

凝胶颗粒中孔穴的体

积，即固定相体积；基质体积(Vg)

:

凝胶颗粒实际骨架体积。2018/9/6柱床体积

(Vt)

:

凝胶柱

所能容纳的总体积Vt=Vo+Vi+Vg25外水体积(Vo)

内水体积(Vi)基质体积(Vg)柱床体积(Vt)洗脱体积

(Ve)

:

将样品中某一组分洗脱

下来所需洗脱液的体积。一般是介于Vo

和Vt之间的。(1)对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故Ve=Vo;(2)对于完全渗透的小分子，由于可以存

在于凝胶柱整个体积内，故Ve=Vt;分子量介于两者之间的分子，其洗脱体积也介于两者之间，但，有时也出现Ve>Vt,这是由于这种分子与凝胶的吸附作用造成的。2018/9/626(2)中等分子(4)吸附分子27(1)完全排阻的大分子(3)完全渗透的小分子2018/9/6凝胶层析洗脱示意图通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积

的物质。该物质分子量大(为200万),呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或

分光光度仪检测(210nm或260nm或620nm)

洗脱体积(即Vo)

。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。2018/9/6

28Vo

的测定2018/9/629Vt的测定2018/9/6

305cm(2)由于溶质分子和凝胶介质间存在多种次

级相互作用，溶质分子可被吸附于凝胶介质

的表面。(3)在凝胶颗粒内部具有较大的比表面积和

较小的自由空间，故溶质分子更易和凝胶介

质接触，因此溶质分子在凝胶颗粒内部较凝

胶颗粒外部更易被吸附。(4)即，色谱过程中除分子排阻作用外，凝

胶对药物分子的吸附作用大于对高分子杂质

的吸附作用。2018/9/6

31有目的的利用药物分子和凝胶间的次级相互作用，使药物分子吸附于凝胶颗粒内表面，

进而改善高分子杂质和药物分子之间的分离

度。(5)在深入研究药物和葡聚糖凝胶的相互作用及流动相对该相互作用的影响的基础，通

过调节色谱过程中的流动相组成、浓度、pH

和流速等参数，调节药物分子和凝胶颗粒间

的相互作用，进而调节高分子杂质和药物分

子间的分离度。2018/9/6

32凝胶色谱系统的分离原理及特点3.SephadexG-10凝胶色谱法分离β-内酰胺抗生素中高分子杂质的概况：在Sephadex

G-10凝胶色谱系统中，理论

上β-内酰胺抗生素三聚体以上的高分子杂质

均集中在Kav=0的色谱峰中；调节各种色谱

条件，既可使β-内酰胺抗生素的寡聚物(如

青霉素类抗生素的二聚物等)和其它高分子

杂质分离，又可使其二者合二为一，因此可用于不同的分析目的。2018/9/6

33三

、色谱条件对β-内酰胺类抗生素在Sephadex

G-10凝胶色谱系统中色谱行

为的影响2018/9/6

34高分子杂质分析方法1.流动相离子强度对溶质保留行为的影响：流动相的离子强度和色谱行为虽然并无直接联系，但一般说来，当流动相中的离子种

类不改变时，离子强度越大，β-内酰胺类抗

生素的Kav值越大。2018/9/6

35色谱条件的影响在被测物浓度较高时，流动相中应含有足量的缓冲盐以改善色谱峰形和分离效果。有研究表明，在流动相中添加中性盐如氯化

钠或增加缓冲液的浓度后，均使离子强度增

加，使β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质得

到有效分离。2018/9/6

362.流动相种类对溶质色谱行为的影响：常用流动相有：柠檬酸缓冲液、硫酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等。改变流动相中缓冲液的种类，可以改变溶

质的色谱行为，对β-内酰胺类抗生素，表现

为其Kav值的改变及色谱峰型的变化。2018/9/6

37色谱条件的影响流动相0.1mol/L头孢菌素的Kav值头孢他啶头孢曲松头孢噻吩柠檬酸缓冲液0.452.522.06硫酸铵0.361.761.45磷酸缓冲液0.311.361.42醋酸缓冲液0.270.791.00碳酸盐缓冲液0.210.550.88硝酸钠0.150.210.58流动相中缓冲液种类对头孢菌素色谱行为的影响2018/9/6

38测定次数缓冲盐0.1mol/L理论板数拖尾因子1磷酸缓冲液31911.43柠檬酸缓冲液23852.542磷酸缓冲液41211.43柠檬酸缓冲液31202.40流动相对头孢他啶高分子杂质色谱行为的影响2018/9/6

39分析证明，影响这种变化的决定因素是缓冲液中的阴离子种类，阴离子所带的负电荷越

多，溶质的Kav值相对越大，色谱峰也越易

拖尾。2018/9/63.流动相pH的影响对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越

大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主

要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。当流动相中有多元酸/盐存在时，pH

通过影响多元酸的解离，改变缓冲液中的阴离子类

型，来改变溶质的保留时间。2018/9/6色谱条件的影响4.洗脱速度的影响流速越大，溶质的保留值减小。反之，溶质的保留值增大。这是由于流速较快时，溶质分子进入凝胶颗粒内部的概率减小，导致与葡聚糖凝胶相

互作用的机会减少之故。2018/9/6

42色谱条件的影响5.溶质保留值和半峰宽的关系β-内酰胺抗生素在Sephadex

G-10凝胶色谱系统中的半峰宽与其保留时间均呈线性关系。也就是说，保留时间越大，半峰宽越大，峰型越难看。2018/9/643色谱条件的影响第三节分子排阻色谱法必中国药典2005版二部规定，分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种

液相色谱技术，其分离原理即为凝胶色谱柱

的分子筛机制。β-内酰胺类抗生素中的高分

子杂质的测定采用分子排阻色谱法。2018/9/6原

理—在Sephadex

G-10凝胶色谱系统中，由于Sephadex

G-10的排阻分子量仅为700道

尔顿，因此，除部分寡聚物外，β-内酰胺抗

生素中的高分子杂质在色谱过程中均不保留；

即所有高分子杂质表现为单一的色谱峰，其

kav=0。2018/9/6自身对照外标法在特定条件下，β-内酰胺抗生素由于分子间的氢键、静电、疏水相互作用等次级相互作

用，可以形成缔合物，导致其表观分子量增

大。此时，在SephadexG-10凝胶色谱系统中和高分子杂质具有相似的色谱行为，即在kav=0

处表现为单一的色谱峰。2018/9/6自身对照外标法在特定条件下缔合的的峰响应指标；再改变

色谱条件，测定样品高分子杂质和药物分离

后

，kav=

0处高分子杂质的峰响应指标；按

外标法计算，既得药品中高分子杂质相当于品本身的相对含量。

472018/流动相B:

水流动相A:磷酸盐缓冲液ex

G-10凝胶品，测定其自身对照外标法利用以色谱系测

定

方

法—

—为什么采用自身对照外标法?定量分析法的理论基础：通过检测器的物质的量与检测器的响应信号成正比，其检

测器响应可以是面积或峰高。定量方法：·外标法·内标法●峰面积归一法·主成分对照法2018/9/6响应值(A或H)含量481.外标法以待测物质的对照品为参照物，根据供试品的量和对照品的量以及对应的响应信号

进行定量的方法。高聚物对照品较难制备，即使制备的高

聚物对照品由于不稳定也较难保存，而且不

同批制备的对照品很难同质。β-内酰胺抗生素高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性。2018/9/6

492.归一化法将测得色谱图上，所有色谱峰面积求和，与每个色谱峰面积相比较，即得每个色谱峰的百分比，把所有的色谱峰的百分比相加即得100%,称为峰面积归一化。对于高分子杂质来说，其含量和药物本身

含量相差甚远，测量误差较大。2018/9/6

50DAD1A,Sig=254.4

Ref=360,100(D:08-LC004JUHE0U0806170617-416.D)mAU140

样品主峰12010080

高分子杂质6040200010

20

30

40

min2018/9/6

515.5353.内标法内标法是结合了峰面积归一法和外标法的优点的一种方法，它在加入内标后，按峰

面积归一法的分析方法进行分析，这就避免

了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的

偶然误差，因而，它的分析精密度也是比较

高的，是气相色谱的一种比较理想的定量分

析方法。2018/9/6

524

.主成分对照法由于Sephadex

G-10凝胶色谱分离系统的柱效较低，进样微量的药物很难表现

出色谱峰。2018/9/6

53基本分析方法2018/9/6

541

.恒流泵1)转速转速范围：0.1-

120rpm,正反转可逆2)调速方式：无级调速配

以线性数码旋钮连续可调3)速度分辩率：30rpm

以下为0.1rpm,30rpm

以

上

硅胶管1)粗细合适2)壁厚1.5mm

2018/9/6

3)耐磨仪

器为1rpm552.玻璃层析柱合理选择层析柱的长度和直径，是保证分离效果的重要环节，理想的层析柱的直径与长度之比一般为1:25～1:100.2018/9/6

56仪器3.检测器β-内酰胺抗生素通常都有较明显的紫外吸收特

征，所以测定中一般选

择紫外检测器，通常用

到的检测波长是254nm。2018/9/6仪器57色谱工作站色谱控制\数据采集\

记录\计算\分析\图谱保存\实验结果编排打印于一体58积分仪选择性记录，进行积分处

理和定量计算3.数据处理系统仪器2018/9/6系统适用性试验1.以蓝色葡聚糖2000的保留时间来表示高分子杂质的保留特征，考察对照品色谱峰及高

分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖2000溶液色谱峰保留时间的比值均应不超过某一限度。中国药典要求是0.93～1.07

。对照品峰和供试品溶液聚合物峰与相应色谱中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值也

是0.93～1.07。2018/9/6

59流动相A:

磷酸盐缓冲液2018/9/6

60流动相B:

水2.理论板数在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖2000峰计算，理论板数均不小于700

。2018/9/6

613.拖尾因子在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖

2000峰计算，拖尾

因子均小于2.0。峰的拖尾因子2018/9/66214.重复性

RSD考察对照品在流动相B系统中重复进样后峰面积的相对标准偏差应符合规定。2018/9/6

63测定过程流动相B:

水测定对照品，在Kav=0处表现为单一的色谱峰，以药物自身为对照品，测定这一

条件下缔合时的峰响应指标。2018/9/6流动相A:

磷酸盐缓冲液测定供试品，测定样品中高分子杂质和药物分离后，Kav=0

处高分子杂质的峰响应指

标。2018/9/6

651.峰响应值的选择2.检测器类型及其线性范围

3.进样量的影响4.对照品异质性的影响影响准确测定的若干因素2018/9/666定义：分离度是指高分子聚合物与药物单体

之间分离程度(或分离能力)。2018/9/6

67分离度1.凝胶对药物吸附作用的强弱与结构有关

2.与洗脱剂组成有关3

.与流动相的离子强度有关4.与流动相的pH有关5.与流动相的流速有关2018/9/6

68分离度影响因素第四节

SephadexG-10凝胶色谱系统有关的实验技术1.凝胶的预处理凝胶：溶

胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙

中充满了作为分散介质的液体(在干凝胶中也可以

是气体),这样一种特殊的分散体系称作凝胶。没

有流动性。内部常含有大量液体。葡聚糖凝胶属于

弹性凝胶弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，

而当重新吸收分散介质时，体积又重新膨胀。2018/9/6

69凝胶粒度的选择：一般来说，细颗粒分离效果好，但流速慢；而粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使

洗脱峰变平而宽。因此，如用细颗粒凝胶宜

用大直径的层析柱，用粗颗粒时用小直径的

层析柱。在实际操作中，要根据工作需要，

选择适当的颗粒大小并调整流速。2018/9/6

70凝胶溶胀方法：商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀

处理，根据所需凝胶体积，估计所需干胶

的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积

约为其吸水量的2倍，例如Sephadex

G-20

的吸水量为20,1克Sephadex

G-20吸水

后形成的凝胶体积约40ml。2018/9/6凝胶再生：对于不锈钢色谱柱其方法是：先用水反复进行逆向

冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分析。对于玻璃层析柱其方法是：将凝胶从柱柱中取出，将已使用过的凝胶先用0.2mol/L氢氧化钠与0.2mol/L氯化钠混合液浸泡半小时后，用水洗至中

性，再装柱。对于长期不使用的硅胶其方法是：将洗好的凝胶

用50%乙醇浸泡，抽干，然后，依次用75%、95%

和无水乙醇浸泡抽干，最后用乙醚浸泡抽干置37℃

烘干后，即可长期保存。2018/9/6

72取层析柱一根，底滤板衬托，并要求滤板

将柱垂直至于铁架上，

颈漏斗(漏斗颈直径约

在柱中加水或洗脱液，

使支持滤板底部完全充

出口关闭。把已经溶胀

从漏斗倒入柱内，胶粒

连续加入。2018/9/6装柱要点：1)凝胶浆浓度应适宜(一般为70%水混悬

液),分散均匀不结团(不宜强烈搅拌)。2)一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝

胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。3)通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液

平衡后，将带色的兰葡聚糖-2000溶液过柱，

观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。2018/9/6

743.

加样加样方法：凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，

用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液

缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床

表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。

然后继续用大量洗脱液洗脱。2018/9/675加

样

量

：加样量与测定方法和层析柱大小有

关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。

一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高),分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5%～10%。样品体积过大，

分离效果不好。2018/9/6

764.洗脱加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速。凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶

液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。洗脱

时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。2018/9/6

77玻璃层析柱：1.装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好

也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，

避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱

装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下

降。2.始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水

分挥发，凝胶变干。2018/9/6

78色谱柱的维护保养3.葡聚糖凝胶耐受压力为0.3兆帕，过高压力

会损伤填料性能。4.防止柱长霉：可用20%乙醇或0.04%叠氮钠保存。5

.防止柱受污染：可用0.2mol/L氢氧化钠与0.2mol/L氯化钠混合液清洗。2018/9/6

79色谱柱的维护保养不锈钢色谱柱：1.在高于室温的条件下使用时，不要在测量完毕立即停泵，应该是继续通流动相直到色

谱柱的温度低于室温为止。如果在色谱柱很

热的时候停泵，当流动相冷却过程中色谱柱

就会进入气泡。2018/9/6

80色谱柱的维护保养2.若色谱柱在短期内不再使用，应用蒸馏水将含盐的流动相从色谱柱中替换掉，将

色

谱

柱从仪器上取下，拧上塑料堵头。3

.色谱柱长期不用，应在4℃储藏。若储藏温度低于0℃,则会降低柱效。4.避免阳光直射，避免与腐蚀性气体接触。2018/9/6

81色谱柱的维护保养对抗生素中高分子杂质的分析根据不同品种的特点和不同质控要求灵活掌握，优先采用

凝胶色谱法，但不排除其它验证良好的其它分析系统的应用，对不同品种，视分离情况和分离要求，将Sephadex

G-10和高效凝胶

色谱系统综合应用。2018/9/6

82总

结高效、快速、简便是抗生素高分子杂质测定

方法的发展目标，也是必然趋势。在2005版

中国药典中，发展较为完善的Sephadex

G-

10凝胶色谱系统对多个品种抗生素高分子杂

质的控制有着重要的意义。现在已有专门的

β-内酰胺抗生素聚合物测定仪，对β-内酰胺

抗生素的高分子聚合物检查方法的研究将起

到推动作用。2018/9/6

83总

结一、1.

β-内酰胺类抗生素中高分子杂质：对药品

中分子量大于药物本身的杂质的总称。其分

子量一般在1000～5000,个别可至约10000

道尔顿。2.分离度：是指高分子聚合物与药物单体之间分离程度(或分离能力)。2018/9/6

84复习题1.

β-内酰胺类抗生素中高分子杂质按其来源分为：

和

。

(外源性杂质、内源性杂质)2.青霉类抗生素高分子杂质有

杂质和

两大类。(蛋白

(多肽)类杂质、聚合物杂质)3.青霉类抗生素样品在储存过程中，多肽类杂质不断生成，其反应速度与

和

有

关

。(水分含量、储存温度)4.

β-内酰胺类抗生素中高分子杂质具有

性和

性。5

.青霉素的聚合反应速度在溶液条件下和

关系密切；在固体条

件下主要和

含

量

有

关

。(

溶

液

的

酸

碱

度

、

样

品

的

水

分

)6.葡聚糖凝胶耐受压力为

,过高压力会损伤填料性能。(0.3兆帕)

7.色谱柱在短期内不再使用，应用

将含盐的流动相从色谱柱中

替换掉，将色谱柱从仪器上取下，拧上塑料堵头。(蒸馏水)8

.色谱柱长期不用，应在

储藏。若储藏温度低于0℃,则会降低柱效。(4℃)2018/9/6

85复习题1.

β内酰胺类抗生素高分子杂质测定中影响分离度的因素

(ABCD)A

.

与洗脱剂的组成有关

B.

与流动相的离子强度有关C.与流动相的PH有关

D.

与流动相的流速有关2

.当流动相中的离子种类不改变时，离子强度越大，β-内酰胺类抗生素

的Kav值

(B)。A.越小

B.

越

大

C.

不变

D.没有影响3

.当改变流动相的离子种类时，其Kav

值会随之变化，决定这种变化的

因素是流动相中的阴离子种类，阴离子所带的负电荷越多，溶质的Kav值相对

(B)A

.越小

B.

越大

C.不变

D.

没有影响4.在色谱过程中，除分子排阻作用外，凝胶对药物分子的吸附作用与对

高分子杂质的吸附作用相比

(C)A

.小于

B.

等于

C.

大于D.

不一定2018/9/6

86复习题1.简述影响β-内酰胺类抗生素中高分子杂质形成的因素?1)青霉素的聚合物的聚合反应速度在溶液条件下和溶液的酸碱度关系密切；在

固体条件下主要和样品的水分含量有关。2)头孢菌素的聚合物固

体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含水量和贮存温度

的关系密切。贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度上升至37℃时，含水量差异对聚

合物含量的影响十分显著。2018/9/6

87复习题2.简要说明凝胶色谱分离的原理?利用凝胶色谱的分子筛机制，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，

一般为几百至几千埃。

让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而所有

的高分子杂质被排阻，进而实现让所有高分

子杂质具有相同的保留时间的设想。2018/9/6

88复习题3.简述影响β-内酰胺类抗生素高分子杂质测定中分离度的因素?1)流动相离子强度对溶质保留行为的影响：离子强度越大，β-内酰胺类抗生素的Kav

值越大。2)流动相种类对溶质色谱行为的影响：缓冲液中的阴离子种类，阴离子所带的负电荷越多，溶质的Ka

v值相对越

大，色谱峰也越易拖尾。3)流动相pH的影响当流动相中有多元酸/盐存在时，pH

通过影响多元酸的解离，改变缓冲

液中的阴离子类型，来改变溶质的保留时间。4)洗脱速度的影响流速越大，溶质的保留值减小。反之，溶质的保留值增大。2018/9/6