基因综合项目工程原理

基因工程原理内容提纲基因工程又称基因操作、重组DNA技术，是P.Berg等于1972年创立。基因工程技术涉及基本过程涉及“切、连、转、选”。该技术有两个基本特点∶分子水平上操作和细胞水平上表达。基因工程中使用各种工具酶，涉及限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其她某些参加DNA合成与修饰酶类。限制性内切核酸酶是基因工程中最重要工具酶，属于水解酶类。依照限制性内切核酸酶作用特点，被分为三大类。Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最惯用酶，该类酶分子量小，专一性强,切割方式有平切和交错切，作用时需要Mg++作辅助因子，但不需要ATP和SAM。第一种被分离Ⅱ类酶是HindⅡ。连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。基因工程中使用连接酶来自于原核生物，有两种类型DNA连接酶∶E.coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶。基因工程中使用重要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染E.coli中分离一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。载体是能将分离或合成基因导入细胞DNA分子，有三种重要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型基本上，依照不同目，浮现了各种类型改造载体。DNA重组连接办法大体分为四种：粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。粘性末端连接法是最惯用DNA连接办法,是指具备相似粘性末端两个双链DNA分子在DNA连接酶作用下，连接成为一种杂合双链DNA。平末端连接是指在T4DNA连接酶作用下，将两个具备平末端双链DNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是运用末端转移酶在载体及外源双链DNA3'端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC)，然后在DNA连接酶作用下，连接成为重组DNA。这种办法可合用于任何来源DNA片段，但办法较繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成或来源于既有质粒一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶辨认序列)，加到载体或外源DNA分子上，然后通过酶切制造黏性末端办法称为接头连接法。基因文库分为基因组文库、cDNA文库等，是指在一种载体群体中，随机地收集着某毕生物DNA各种克隆片段，抱负地包括着该物种所有遗传信息。DNA重组分子在体外构建完毕后，必要导入特定受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接变化其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子转化。当前惯用诱导感受态转化办法是CaCl2法（图3-20），此外也可以用基因枪等办法转化外源DNA。重组体筛选有遗传学办法、核酸杂交筛选法等。基因工程技术是当代生物技术核心，当前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大应用前景，并形成了一大批生物技术产业。基因工程是以分子遗传学为理论基本，以分子生物学和微生物学当代办法为手段，将不同来源基因(DNA分子)，按预先设计蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以变化生物原有遗传特性，获得新品种，生产新产品；或是研究基因构造和功能，揭示生命活动规律。基因工程技术诞生于20世纪70年代初，它是一门崭新生物技术科学，它创立和发展使生命科学产生了一次重大奔腾，证明并实现了基因可操作性，使人类从简朴地运用天然生物资源走向定向改造和创造具备新品质生物资源时代。基因工程技术诞生至今已经获得了辉煌成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注当前沿学科之一，基因工程也是当今新产业革命一种重要构成某些。第一节基因工程技术诞生基因工程又称基因操作(genemanipulation)，重组DNA(recombinantDNA)技术，是70年代发展起来遗传学一种分支学科。一、基因工程技术诞生1972年，P..Berg等在PNAS上刊登了题为∶“将新遗传信息插入SV40病毒DNA生物化学办法：具有λ噬菌体基因和E.coli半乳糖操纵子环状SV40DNA”，标志着基因工程技术诞生。SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径为450球形病毒，分子量为28×106道尔顿。SV40DNA是环状双链构造，全长5243个碱基对，编码三个衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和一种T抗原。SV40DNA上有一种限制性内切酶E.coRⅠ切点。Berg等一方面用化学办法构建了一种二聚体环状SV40DNA(图3-1)。图3-1重组SV40二聚体构建(引自Berget.al,1972)当时所用连接办法是同聚物谱尾法，重组体鉴定重要是通过电子显微镜比较分子量大小。当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后可以重新环化，并且可以同此外分子重组。于是她们进行第二步实验就是从λdvgalDNA中制备具有E.coli半乳糖操纵子DNA，用上述同样办法进行重组连接，并获得成功。Berg等工作是人类第一次在体外给遗传物质动手术，标志着一种新时代到来，为此她获得了1980年诺贝尔化学奖。二、基因操作基本过程和特点基因工程操作可用图3-2表达∶图3-2基因工程基本过程(引自Old&Primrose,1980)它所涉及过程可用“分(合成)、切、连、转、选、鉴”六个字表达。分(合成)∶指DNA制备，涉及从生物体中分离或人工合成。分离制备或合成制备DNA办法均有诸各种。切∶即在体外将DNA进行切割，使之片段化或线性化。连∶即在体外将不同来源DNA分子重新连接起来，构建重组DNA分子。转∶即将重组连接DNA分子通过一定办法重新送入或细胞中进行扩增和表达。选∶从转化全群体中将所需要目克隆挑选出来；鉴∶就是进行对筛选出来重组体进行鉴定，由于有些重组体并非是所需要，必须通过度析鉴定。基因工程有两个基本特点∶分子水平上操作和细胞水平上表达。遗传重组是生物进化推动力，自然界中发生遗传重组重要是靠有性生殖。基因工程技术诞生使人们可以在试管里进行分子水平上操作，构建在生物体内难以进行重组，然后将重组遗传物质引入相应宿主细胞，让其在宿主细胞中进行工作。这事实上是进行无性繁殖，即克隆，因此基因工程普通有称为基因克隆。第二节限制性内切核酸酶外科医生给患者动手术需要手术刀，基因工程师们给DNA分子(基因)动手术需要分子手术刀，这就是工具酶。基因工程中使用工具酶诸多，涉及限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其她某些参加DNA合成与修饰酶类，最重要是限制性内切核酸酶。基因工程上把那些具备辨认双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链构造核酸内切酶统称为限制性内切核酸酶。一、限制性内切核酸酶发现1952年Luria、Human在T偶数噬菌体、1953年weigle、Bertani在λ噬菌体对大肠杆菌感染实验中发现了细菌限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象进一步研究，导致限制性内切核酸酶发现。噬菌体在某一特定细菌宿主中生长能力，取决于它最后在其中繁殖细菌是什么菌株。例如，将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到此外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株滴定度可差好几种数量级。第二个菌株释放噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染本来宿主菌，再将释放子代噬菌体重新感染第二个菌株时，感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制限制作用(host—Controlledrestriction)。用放射性同位素标记噬菌体进行实验成果表白，在受感染宿主细胞中，噬菌体生长限制伴有噬菌体DNA迅速降解，然而，用作繁殖噬菌体感染宿主菌株并不导致类似噬菌体DNA降解。如果某一细菌细胞具备一种能选取性降解来自侵染病毒(或其她来源)核酸酶，那么，它必要能将这种外来DNA同它自己DNA区别开来，之因此可以如此，乃是通过稍为宿主控制修饰作用(host-controlledmodification)。因而，限制(restriction)作用是指细菌限制性核酸酶对DNA分解作用，限制普通是指对外源DNA侵入限制。修饰(modification)作用是指细菌修饰酶对于DNA碱基构造变化作用(如甲基化)，经修饰酶作用后DNA可免遭其自身所具备限制酶分解。到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制－修饰系统(restriction—modificationsystem．R-Msystem)。该系统中有作用于同一DNA两种酶，即分解DNA限制酶和变化DNA碱基构造使其免遭限制酶分解修饰酶，并且，这两种酶作用于同一DNA相似部位。普通说来，不同种细菌或不同种细菌菌株具备不同限制酶和修饰酶构成限制-修饰系统。1968年，Meselson从E．coliK株中分离出了第一种限制酶EcoK，同年Linn和Aeber从E．coliB株中分离到限制酶EcoB。遗憾是，由于EcoK和EcoB这两种酶辨认和切割位点不够专一，在基因工程中意义不大。1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，可以特异性地切割DNA，这个酶日后命名为HindⅡ，这是第一种分离到Ⅱ类限制性内切核酸酶。由于此类酶辨认序列和切割位点特异性很强，对于分离特定DNA片段就具备特别意义。二、限制性内切核酸酶命名和分类（一）限制性内切核酸酶命名按照国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶数量众多，并且越来越多，并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆，1973年Smith和Nathans对内切酶命名提出建议，1980年，Roberts对限制性酶命名进行分类和系统化。限制性酶采用三字母命名原则，即属名+种名+株名个一种首字母，再加上序号，将限制性内切核酸酶命名要点列于表3-1。表3-1限制性内切核酸酶命名要点条目要点基本原则3-4个字母构成，方式是:属名+种名+株名+序号首字母取属名第一种字母，且大写第二字母取种名第一种字母，小写第三字母①取种名第二个字母，小写；②若种名有词头，且已命名过内切酶，则取词头后第一字母代替第四字母若有株名，株名则作为第四字母，与否大小写，依照本来状况而定顺序号若在同一菌株中分离了几种限制性内切核酸酶，则按先后顺序冠以I、II、III,.....等如：EcoK：Escherichiacoli

K(大肠杆菌K株)（二）限制性内切核酸酶分类限制性内切核酸酶作用特点，将它们分为三大类。1.I类限制性内切核酸酶I类限制性内切核酸酶分子量较大，普通在30万道尔顿以上，普通由三个不同亚基所构成。例如限制性酶EcoB是由R(135kD)，M(62kD)和S(55kD)三种亚基构成复合酶，这三个亚基分别由不同基因编码。全酶总分子量为449kD,共5个亚基，其中R亚基和M亚基各两分子。Ⅰ类酶不但是一种核酸内切酶，同步在酶分子上还具备甲基化酶和ATPase活性，因此是具备各种酶活性复合酶类。作用时除了需要Mg++作辅助因子外，还规定ATP和S腺苷甲硫氨酸(SAM)存在。Ⅰ类酶具备特异辨认序列，大概15个碱基对。Ⅰ类酶虽然可以在一定序列上辨认DNA分子，并能同DNA分子作用，因其辨认DNA后，要朝一种方向或两个方向移动一段距离(普通为1000个碱基左右)，并且要形成一种环才干切割DNA(图3-3)，因此辨认位点和切割位点不一致，产生片段较大。图3-3I类酶作用方式(引自Lewin,1997)2.Ⅲ类限制性内切核酸酶Ⅲ类限制性内切核酸酶也是基因工程中不惯用酶，分子量和亚基构成类似于Ⅰ类酶，作用方式基本同Ⅱ类酶。如EcoP1是由两个亚基构成，一种亚基(M亚基)负责位点辨认和修饰。另一种亚基(R亚基)具备核酸酶活性(图3-5)。切割DNA时需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必须。图3-4Ⅲ类限制性内切核酸酶(引自Lewin,1997)3.Ⅱ类限制性内切核酸酶此类酶分子量较小.普通在2-4万道尔顿，普通由2-4个相似亚基所构成。它们作用底物为双链DNA，很少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA/RNA杂种双链。此类酶专一性强，它不但对酶切点邻近两个碱基有严格规定，并且对更远碱基也有规定，因而，Ⅱ类酶既具备切割位点专一性，也具备辨认位点专一性，普通在辨认序列内切割。切割方式有平切和交错切，产生平末端DNA片段或具备突出粘性末端DNA片段(5'或3'粘性末端)。作用时需要Mg++作辅助因子，但不需要ATP和SAM。Ⅱ类酶与相应甲基化酶在蛋白亚基上尚未发既有什么关系，第一种被分离Ⅱ类酶是HindⅡ。三.Ⅱ类限制性内切核酸酶性质1.辨认序列特异性在3类限制性内切核酸酶中，Ⅱ类限制性内切核酸酶特异性最强。大多数Ⅱ类限制性内切核酸酶辨认序列是回文序列。如BamHI和BglI都是辨认六个碱基DNA序列(图3-5)，都是完全回文序列。这段序列有两个基本特性，第一是可以中在间划一种对称轴，两侧序列两两对称互补配对，第二个特点是两条互补链5’到3’序列构成相似，即将一条链旋转1800，则两条链重叠。图3-5Ⅱ类限制性内切核酸酶辨认回文序列（引自D.Voet&VoteJ.G.1995）2.限制性内切核酸酶切割频率与速度切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测切点数。由于DNA是由四种类型单核苷酸构成，假定DNA碱基构成是均以，而限制性内切核酸酶辨认位点是随机分布，那么对于任何一种限制性内切核酸酶切割频率，理论上应为1/4n，n表达该限制性内切核酸酶辨认碱基数。如辨认4个碱基限制性内切核酸酶，其切割频率应为每256个碱基有一种辨认序列和切点(1/44=1/256)，辨认5个碱基限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1024个碱基有一种辨认序列和切点，余下类推。事实上因DNA分布是不均一,且有大量重复序列,加上内切酶切点具备GC倾向,因此实际频率偏低。犹如是辨认6个碱基限制性内切核酸酶，切割频率相差很大∶EcoRI4000;BamHI:6000;SalI:8000;HpaII:200。依照限制性内切酶切割DNA所产生产物末端，发现限制性内切酶对DNA切割有两种方式，即平切和交错切。所谓平切，就是限制性内切酶在DNA双链相似位置切割DNA分子，这样产生末端就是平末端。交错切就是限制性内切酶在DNA双链不同位置切割DNA，产生DNA片段末端不是平齐(图3-6)。图3-6平末端与黏性末端(Hartl,1991)Ⅱ类限制性内切酶切割产物有平末端和粘性末端(cohesiveend)。粘性末端是指DNA分子两端具备彼此互补一段突出单链某些，这一小段单链某些和同一分子另一端或其他分子末端单链某些如果互补话，则能通过互补碱基之间配对，形成双链。并在DNA连接酶作用下，使同一DNA分子两端连接成环状,或使两个分子连成一大线状分子。不同限制性内切酶切割DNA产生三种不同类型末端(表3-3)。表3-3某些限制性内切酶及产生末端5'-粘性末端3'粘性末端平末端酶辨认序列酶辨认序列酶辨认序列TaqIT/CGAPstICTGCA/GAluIAG/CTClaIAT/CGATSacIGAGCT/CFnuDⅡCG/CGMboI/GATCSphIGCATG/CDpnIGA/TCBglⅡA/GATCTBdeIGGCGC/CHaeⅢGG/CCBamHIG/GATCCApaIGGGCC/CPvuⅡCAG/CTGBclIT/GATCAKpnIGGTAC/CSmaICCC/GGCHindⅢA/AGCTT

NaeIGCC/GGCNcoIC/CATGG

HpaIGTT/AACXmaIC/CCGGG

NruITCG/CGAXhoIC/TCGAG

BalITGG/CCAEcoRIG/AATTC

MstITGC/GCASalIG/TCGAC

MhaⅢTTT/AAAXbaIT/CTAGA

EcoRⅤGAT/ATC基因分子手术是相称复杂过程，除了需要限制性内切酶外，还需要其她某些工具酶涉及连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、末端修饰酶等，对DNA或RNA进行各种各样修饰。其中最重要是连接酶。第三节基因工程载体载体(vector，vehicle)本意就是媒介体，基因工程上载体是能将分离或合成基因导入细胞DNA分子，称为克隆载体。基因工程中有三种重要类型载体∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，其中质粒DNA是最惯用载体，但运载能力低，柯斯质粒是质粒和λ噬菌体DNA结合体，运载能力最高(图3-7)。在这三种类型基本上，依照不同目，浮现了各种类型改造载体。图3-7三种类型载体(引自Greene,1998)一、质粒载体质粒(plasmid)是染色体以外遗传物质，它是双链闭合环状DNA分子，其大小可从1kb到200kb左右，可以在宿主内运用宿主酶系统进行复制。质粒是基因工程重要载体。(一)质粒概念1946—1947年间，Lederberg和Tatum发现了细菌接合现象，这是细菌有性繁殖方式。此后不久，便弄清了这种接合是两种不同交配型(接合型)，遗传信息总是从供体(雄性)转移到受体(雌性)。当两种不同交配型细菌互相辨认和接合后来，雄性细胞致育因子，通过细胞表面构造传递到雌性细胞，这种致育因子日后称为F因子。1952年，Lederberg指出，细菌F因子与高等生物细胞质中染色体外遗传单元极为相似，并正式提出了“质粒”这一名称，以区别于染色体遗传单元。普通来讲，质粒是细胞中可以独立复制复制子，并在细胞分裂时能稳定传递给子代细胞。虽然质粒对细胞生存没有影响，但质粒DNA上也有某些编码基因，赋予宿主细胞某些特性。自发现能赋予细菌性别特性F因子后来，又在大肠杆菌中发现了一种可以编码抗菌物质——大肠杆菌素Col质粒，涉及ColB，ColV，ColE等。由这些因子产生抗菌物质称细菌素(bacleriocin)，是细菌所合成一种蛋白质，对于同种或近缘种具备毒性。合成细菌素能力和对于细菌素抗性，都由染色体外遗传因子所控制。在1959一1960年间，日本科学家在研究用强效抗生素治疗菌痢患者时，发现病原菌志贺氏菌具有使其同步能抗几种抗生素基因，并且，这种抗药性基因能以和F因子非常相似方式转移给其她肠道细菌，这就是抗药因子(R因子)。抗药因子(resistancefactor)事实上是控制细菌抗药性一种质粒，能在细菌间转移，由抗药性转移因子和抗药性基因两某些构成。每个抗药因子上常具备几种抗药性基因。（二）质粒DNA基本性质大多数质粒DNA是是环状双链DNA分子。如果两条链都是完整环，这种质粒DNA分子称为共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircular，CCCDNA)。CCCDNA有两种构型，超螺旋DNA(supercoliedDNA，SCDNA)和松弛DNA(RelaxedDNA),分别是由DNA促旋酶(DNAgyrase)和拓朴异构酶(topoisomerase)作用成果。如果质粒DNA中有一条链是不完整，那么这种DNA分子就称为开环(opencircles,OCDNA)，开环DNA普通是由内切酶或机械剪切导致图3-8)。从细胞中分离质粒DNA时，质粒DNA经常会转变成超螺旋构型。图3-8质粒DNA三种构型(引自Old&Primrose,1980)溴化乙啶(ethidiumbromide，EtBr)是一种扁平分子，可以插入到DNA分子碱基对之间，引起双螺旋某些解旋，从而变化了DNA体积和密度。图3-9相对分子质量相似构型不同质粒DNA琼脂糖凝胶电泳（引自Old&Primrose，1980）由于不同构型DNA插入EB量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中迁移率也不同，CCCDNA泳动速度最快，OCDNA泳动速度最慢，LDNA居中(图3-9)，因此很容易通过凝胶电泳和EB染色办法将不同构型DNA分别开来。（三）质粒分类依照质粒拷贝数将质粒分为松弛型质粒和严紧型质粒。质粒拷贝数(plasmidcopynumbers)是指细胞中单一质粒份数同染色体数之比值,惯用质粒数/每染色体来表达。不同质粒在宿主细胞中拷贝数不同，

松弛型质粒(relaxedplasmid)复制只受自身遗传构造控制，而不受染色体复制机制制约，因而有较多拷贝数。普通可达10—15个/每染色体。并且可以在氯霉素作用下进行扩增，有质粒扩增后，可达到3000/每染色体(ColE1，可由24个达到1000至3000个)。此类质粒多半是分子量较小，不具传递能力质粒。基因工程中使用多是松弛型质粒。严紧型质粒(stringentplasmid)在寄主细胞内复制除了受自身复制机构控制外，还受染色体严紧控制，因而拷贝数较少，普通只有1—2个/每染色体。这种质粒普通不能用氯霉素进行扩增。严紧型质粒多数是具备自我传递能力大质粒。质粒复制特性是受复制子控制。基因工程中使用质粒多数是松弛性质粒载体。（四）载体条件就克隆一种基因(DNA片段)来说，最简朴质粒载体也必须涉及三个某些(图3-10)∶复制区，具有复制起点；选取标记，重要是抗性基因；克隆位点，便于外源DNA插入。就复制特性来讲，规定载体必须有独立复制起点，最佳是松弛型复制，这样便于得到大量拷贝。有时需要有各种复制起点，可以在不同宿主细胞中复制，扩大宿主范畴。具备适当克隆位点，便于外源DNA插入。克隆位点事实上限制性酶切位点，最佳是具备各种限制性内切酶单切点，这样适应性强，克隆以便，如果一种酶在载体上有各种切点，就会限制该切点使用。具备可检测选取标记，也是一种重要基本条件，这种选取标记最佳是可以赋予宿主易于检测表型。选取标记就是常说报告基因(reportgenes)，涉及抗生素抗性标记，以及某些生化表型标记。此外，一种抱负质粒载体必须具备低分子量，由于小分子质粒DNA易于操作，不容易被损伤，也容易被分离纯化。普通说小分子量质粒分子拷贝数比较高，酶切位点也少。图3-10质粒载体基本构造二、杂合载体除了质粒载体外，噬菌体DNA也可作为载体，但是都是改造过，自然病毒DNA不能作为载体。当前在基因工程中使用载体大多是质粒和噬菌体杂合载体。（一）柯斯质粒(cosmid)载体cosmid是英文cossite-carryingplasmid缩写，本意是带有粘性末端位点质粒，因而，柯斯质粒是人工建造具有λDNAcos序列和质粒复制子特殊类型质粒载体。柯斯质粒构建普通都是运用质粒复制子、选取标记，加上λcos位点序列及与包装关于序列，构建科斯质粒可以较好地用于基因克隆(图3-11)。图3-11柯斯质粒载体克隆(引自Lodishetal,1986)初期构建科斯质粒载体有某些局限性，如克隆位点较少，抗性标记单一，容栽能力不大，日后进行了某些改进，克服了这些局限性。柯斯质粒具备如下特点：具备质粒复制子。当前构建柯斯质粒大多具备pMB1复制子或ColE1复制子，因此进入寄主细胞后可以象质粒同样进行复制，并且可以被氯霉素扩增。具备质粒载体抗生素抗性基因选取标记。如果在这些标记中有克隆位点话可用插入失活法进行筛选。例如上面构建MuA-3就具备四环素抗性基因。具备λ噬菌体包装和转导特性。由于柯斯质粒具备λDNAcos位点和相应包装序列，因而在克隆了恰当大小外源DNA后来可以被包装进入噬菌体蛋白颗粒，并能进行转染。转导能力比纯质粒大3个数量级。进入寄主细胞后，又可以自我环化。但它不能同寄主染色体DNA整合，也不会产生子代噬菌体裂解寄主。溶载能力大。这是柯斯质粒最大长处。被克隆DNA大小具备上限和下限，这是由于柯斯质粒最后是被包装到噬菌体颗粒，它最后大小应在噬菌体基因组75%-105%之间。由于载体分子普通在5kb左右，因此克隆最大片段在45kb;如果载体分子量为15kb话，克隆最小片段为19kb。因而柯斯质粒适合构建真核生物基因库，而不适合克隆原核生物基因。（二）pUC载体系列构建美国加州大学Vieira和Messing运用pBR322和M13载体长处，构建了一种更小载体，称为pUC7（图3-12），并在此基本上发展了pUC载体系列。图3-12pUC载体构建(引自Winnacker,1987)pUC载体具备诸多长处∶①多克隆位点；②松弛复制；③有氨苄青酶素抗性；④可通过化学显色筛选。当前最惯用pUC载体是pUC18(图3-13),它分子量小，具备多克隆位点和易于选取分子标记，并且是松弛型复制，在正常状况下，它拷贝数可达上千个，因此不需要用氯霉素进行扩增。图3-13pUC18质粒载体图谱二、基因文库技术基因文库(GeneLibrary)是指在一种载体群体中，随机地收集着某毕生物DNA各种克隆片段，抱负地包括着该物种所有遗传信息(图3-18)。因而，基因文库是人工构建某毕生物基因“活期储蓄所”，依照构建办法不同,分为基因组文库、cDNA文库等。依照基因库含量,又分为全库和特异性库,全库具有某毕生物所有遗传信息,而特异性库是不完整,如差示库。初期将通过构建基因文库来筛选所需克隆办法称为鸟枪法。图3-18基因文库技术（J.J.Greene&RaoV.B.,1998）第三节体外重组一、体外重组办法DNA重组连接办法大体分为四种：粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。1.粘性末端连接法粘性末端连接(Cohesiveendligation)是指具备相似粘性末端两个双链DNA分子在DNA连接酶作用下，连接成为一种杂合双链DNA(图3-14)。粘性末端可由辨认回文序列内切酶所产生，或是用末端转移酶来制备。凡是辨认回文序列内切酶切割DNA产生末端都是粘性末端，只有用同一种酶切割产生相似粘性末端才干通过末端单链碱基配对并在DNA连接酶作用下进行连接。

图3-14黏性末端连接法（引自Snyder&Champness，1977）粘性末端连接法是最惯用DNA连接办法，酶切片段基本不需作什么解决就可以用于连接，既经济又省时。由于大多数限制性内切酶都可以产生粘性末端，操作以便。此外,通过粘性末端连接重组体，其外源片段很容易回收，只要用本来酶切割重组体就可以了。此外，也可以通过双酶切来获得黏性末端，并可进行定向重组连接（图3-15）。图3-15双酶切进行定向重组连接（引自Snyder&Champness，1977）平末端连接(bluntendligation)是指在T4DNA连接酶作用下(可加入适量RNA连接酶)，将两个具备平末端双链DNA分子连接成杂种DNA分子。平末端连接效率比粘性末端连接效率低得多,因此普通在连接反映体系中要适量添加增进大分子凝聚凝聚剂,以提高平末端DNA连接效率。惯用是PEG8000，加入后，可以起到两个作用：一是可将平末端连接效率提高1-3个数量级；二是变化连接产物分布，抑制分子内连接，增进分子间连接，得到连接产物重要是重组体。平末端连接不利之处是连接效率低，需要大量连接酶，有时为了提高连接效率，普通要补加RNA连接酶。连接后，缘由限制性内切酶内切酶切点要消失，因此不易回收插入外源DNA片段。3.同聚物加尾法所谓同聚物加尾(homopolymertailsjoining)连接就是运用末端转移酶在载体及外源双链DNA3'端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC)，然后在DNA连接酶作用下，连接成为重组DNA。这种办法可合用于任何来源DNA片段，但办法较繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用（图3-16）。同聚物接尾法事实上是一种人工粘性末端连接法，具备诸多长处:①一方面不易自身环化,这是由于同一种DNA两端尾巴是相似，因此不存在自身环化。②由于载体和外源片段末端是互补粘性末端，因此连接效率较高。③用任何一种办法制备DNA都可以用这种办法进行连接，因此是一种通用体外重组办法。图3-16同聚物尾连接法(引自Old&Primrose,1980)1.基因组DNA文库所谓基因组文库(genomicDNALibrary)，就是用基因工程办法,人工构建具有某毕生物基因组DNA各种片段克隆群。普通以改造噬菌体DNA或柯斯质粒作为载体，涉及下列过程(图3-19)：①高分子量染色体DNA制备，②体外重组连接，③包装蛋白制备，④重组体体外包装，⑤将重组DNA导入寄主细胞，⑥筛选。建造基因组文库不但可以大量扩增含量很少单拷贝构造基因，也可以克隆调控基因，有助于研究基因构造、功能和调控机理。基因组文库同遗传学上所讲基因库是完全不同概念。基因库(genepool)是指在行有性生殖某一群体中，能进行生殖个体所含总遗传信息。在基因组文库构建中，由于使用载体不同，分为噬菌体载体和柯斯质粒载体构建基因组文库、YAC文库、BAC文库。图3-19基因组文库技术(引自Griffithsetal.1996)2.cDNA文库同mRNA互补DNA称为cDNA。mRNA为模板合成cDNA可以用于基因克隆化，也可用这种办法制备特异性杂交探针。cDNA文库是以某毕生物总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反向转录酶作用下，一方面合成一互补DNA，即第一链，破坏RMA模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到双链DNA称为cDNA基因。选用适合载体，将合成cDNA基因重组导入寄主细胞，经筛选得到cDNA基因克隆群称为cDNA文库(completementDNALibrary)(图3-20)。由于cDNA技术合成是不含内含子功能基因，因而是克隆真核生物基因一种通用办法。图3-20cDNA文库构建(引自Old&Primrose,1980)由于细胞内基因在表达时间上并非是统一,具备发育阶段性和时间性,有些则需要特殊环境条件。因此,cDNA文库是不也许构建得十分全,也就是说任何一种cDNA文库都不也许包括某毕生物所有编码基因。因此在构建cDNA文库时应依照研究目不同而选用不同生物材料作为RNA分离出发材料,有些甚至要通过特殊诱导解决以提高所需DNA丰度。第五节重组DNA转移、筛选与鉴定转化是基因工程操作中一项十分重要工作。DNA重组分子在体外构建完毕后，必要导入特定受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接变化其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子转化(transformation)。重组体筛选有两层涵义,一是将携带有外源插入DNA片段克隆挑选出来,二是将将携带有特定外源插入片段重组体挑选出来。鉴定则是对筛选重组体进行最后鉴别。一、重组DNA转化可以接受转化作用细菌生理状态叫感受态。细菌感受态是在恰当生长条件下获得一种生理特性。要强调是：感受态是关于转化因子被吸取生理状态，而不是关于转化因子进入细胞后能否被接受生理状态。处在感受态受体细菌，其吸取转化因子能力为普通细菌生理状态千倍以上，并且不同细菌间感受态差别往往受自身遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素影响。在自然条件下，大多数类型细菌不浮现感受态，也不发生转化。然而可以通过某些化学诱导办法来制备感受态，用这种办法得到感受态就称为人工诱导感受态细胞。当前惯用诱导感受态转化办法是CaCl2法（图3-21），此外也可以用基因枪等办法转化外源DNA。图3-21钙诱导转化二、重组体遗传学筛选法所谓遗传学办法(geneticselection)重要是依照受体细胞接受了重组DNA分子后所发生遗传表型变化直接选取重组体办法。遗传表型变化涉及抗药性、缺陷基因功能互补表型及噬菌斑变化等。这些表型变化，有些是载体提供表型特性，有些则是插入序列提供表型特性。选取办法重要是依照平板上可见表型变化，用于选取平板涉及普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表达抗生素平板、显色平板等，由于这些办法都是直接从平板上筛选,因此又称为平板筛选法。（一）插入失活筛选法从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内位点后，使这个基因丧失了原有功能叫插入失活(insertionalinactivation)。图3-22插入失活原理图3-23聚合酶链反映（引自Watsonetal，1992）1.抗性基因插入失活筛选法依照抗生素抗性基因插入失活原理而设计插入失活法是重组体惯用筛选办法。如非重组pBR322质粒DNA上四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常，表型为AprTcr。带有这种质粒受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素双抗性平板上生长。但是，如果在该质粒四环素抗性基因内插入外援片段，就会导致四环素抗性基因失活，变成AprTcs，携带这种质粒宿主菌可以在氨苄青霉素平板上生长，而不能在四环素抗性平板上生长(图3-22)。2.蓝白斑筛选法依照抗生素抗性基因插入失活原理而设计插入失活法需要进行菌落平板影印复制，才可以将所需重组体挑选出来，大大增长了筛选工作量。日后，人们设计了以β-半乳糖苷酶产生作为颜色筛选标记载体，简化了筛选程序，提高了敏捷度。此类载体系统涉及M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们共同特点是载体上携带一段细菌lacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶一段146个氨基酸α-肽，载体转化受体菌为lacZΔM15基因型。这样，载体同宿主通过互补，具备完整β-半乳糖苷酶活性。如果在载体lacZ基因中插入外源DNA，导致lacZ基因失活，不能合成α-肽，失去同宿主互补，不能形成有功能β-半乳糖苷酶，失去分解X-gal能力。在X-gal平板上，含阳性重组体细菌为物色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体)；非重组体转化细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。显色反映筛选办法比较简朴，但是β-半乳糖苷酶合成需要诱导。实验中起诱导作用是安慰诱导物--IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，作用底物是X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。普通是将X-gal和IPTG混合后，涂布在固体平板表面。(二)PCR法聚合酶链反映(polymerasechainreaction，PCR)是一种体外扩增特定DNA序列新技术，这种DNA体外扩增是通过同DNA双链互补两个引物在DNA聚合酶作用下，进行引物延伸来完毕。在反映系统中，需要有：①模板(具有特定序列DNA分子)。②两个寡聚核苷酸引物，这两个引物可同双链DNA分子互补链杂交，并且位于靶DNA欲扩增区两侧。③耐热DNA聚合酶。④4种脱氧核糖单核苷酸。然后通过不同温度循环进行DNA扩增(图3—23)。这一技术是KaryMullis在1985年创造，并于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR应用十分广泛，并且可通过菌液PcR进行重组克隆迅速筛选。基本办法是从抗性平板上挑取单菌落接种至250μLLB培养基中，200r/min振荡培养8h后来，取1μL菌液进行裂解制备模板进行PCR筛选。（三）核酸杂交筛选法核酸杂交又叫分子杂交(molecularhybridization)，是鉴定和筛选重组体一种办法。原理是：两条具备碱基互补序列DNA分子变性后，在溶液中一起进行复性时，可以形成杂种双链DNA分子。同样，一条DNA链与之具备互补碱基序列RNA链在一起复性时，也能形成双链构造(DNA-RNA杂交体)。杂交涉及下列过程：①DNA“熔解”，即变性，目是使双螺旋解开成为单链，这可将DNA溶液温度升高超过Tm值(解链温度)即可；②退火，即DNA复性，将加热过DNA溶液缓慢冷却即可发生。杂交双方是待测核苷酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆基因片段，也可以是未经克隆基因组DNA或是细胞总RNA。核酸杂交办法两个特点是高度特异性及高度敏捷性。1.菌落杂交在大量筛选重组细菌细胞时，需要从中寻找出为数很少具有目序列细胞。此外.在运用插入失活、显色反映等手段得到含重组质粒细菌细胞后，还需要证明这些重组质粒与否含所需要目序列。若将所得菌落逐个扩大培养，提取质粒DNA，然后用Southern杂交法固然可以鉴定重组质粒，不但工作量大，又耗费财力，用菌落杂交(colonyhybridization)(图3-24)，就以便得多。一方面要将转化受体菌在适当琼脂平板上制成单菌落,然后将菌落复制到硝酸纤维素滤膜上，保存主平板,将硝酸纤维素滤膜上菌落进行原位溶菌、原位释放DNA、原位进行DNA变性、中和洗涤后进行原位固定。然后同特异探针进行杂交,通过放射自显影后,有杂交信号即为重组体,对照主平板则可将重组体选取出来。图3-24菌落杂交基本过程(引自Old&Primrose,1980)2.Southern杂交Southern杂交(Southernhybridization)是1975年Southern建立起来一种杂交办法，属固相-液相杂交。该法重要特点是运用可毛细现象将DNA转移到固体支持物上,称为Southern转移或Southern印迹(Southernblotting)。它一方面用适当限制性内切酶将DNA切割后，进行电泳分离后，运用干燥吸水纸产生毛细作用，使液体通过凝胶，从而使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面，然后进行杂交(图3-25)。图3-25Southern杂交中DNA转移(引自Albertsetal.)3.Northern杂交Northern杂交(NorthernHybridization)是分析RNA一种办法,它基本原理是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离,再转移到尼龙膜等固相膜载体上,用放射性同位素标记DNA或RNA特异探针对固定于膜上mRNA进行杂交,洗膜去除非特异性杂交信号,经放射自显影,对杂交信号进行分析。将杂交mRNA分子在电泳中迁移位置与原则分子量分子进行比较,即可懂得细胞中特定基因转录产物大小,对杂交信号强弱比较，可以懂得该基因表达mRNA强弱。这一技术应用十分广泛,惯用于基因表达调控、基因构造与功能、遗传变异及病理研究。重要用来检测外源基因在受体细胞中与否转录成RNA。

Northern印迹原理同Southern印迹。但有两点不同：其一是转移对象不同，Northern印迹是将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上过程。其二，虽然RNA电泳前不需向DNA那样进行酶切，但也需要变性。但是变性办法是不同，它不能用碱变性，由于碱变性会导致RNA水解。

Northern杂交与Southern杂交重要区别是在变性剂存在下，用琼脂糖进行电泳分离RNA。变性剂作用是防止RNA二级构造发夹环形成，保持其单链线性状态。第六节生物技术及应用基因工程技术发展推动了生物技术(biotec}lnokogy)发展，当代生物技术作为一门综合性学科，与当代微生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、分子生物学和化学工程等多学科密切有关。生物技术产业从20世纪80年代开始起步，通过发展，当前在农牧业、食品、医药等领域得到广泛应用。生物技术产业市场逐渐形成，其前景辽阔，将成为21世纪经济支柱产业。(一)细胞工程细胞工程(cellengineering)是运用细胞全能性，在细胞或细胞器水平上变化细胞某些遗传特性，以改良其性状、获得有用基因产物或加速细胞及生物体繁殖综合技术，可分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程，是以细胞培养技术为基本，通过细胞融合、细胞核移植、动物克隆、染色体工程和生物反映器来实现。1．细胞融合细胞融合(cellfusion)又称体细胞杂交(somatichybridization)，是指两个不同来源细胞，彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞基因有也许都被表达，打破远缘生物不能杂交屏障，形成新物种或新品种技术。1975年，英国剑桥大学科学家科莱尔(G．Kohler)和米尔斯坦(C．Milstein)用细胞融合技术将能分泌抗体B淋巴细胞(绵羊红细胞、免疫小鼠脾细胞)与具备无限生长能力肿瘤细胞(小鼠骨髓瘤细胞)融合，得到了既能持续产生单一抗体又能在体外无限繁殖杂合细胞(杂交瘤细胞，hybridomacell)(图3—26)，通过细胞培养将杂合细胞克隆为单纯细胞系(单克隆系)，由此类细胞系可获得构造和特性完全相似高纯度抗体，即单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)。这一技术创立在生物医学领域获得重大突破，两位科学家因而荣获1984年诺贝尔生理医学奖。图3—26运用细胞融合技术制备单克隆抗体(引自Kuby，1994)如今这种细胞融合技术已在动物间实现了小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，甚至于小鼠和人等许多远缘和超远缘体细胞杂交。虽然当前动物杂交细胞还只停留在分裂传代水平，不能分化发育成完整个体，但在理论研究和基因定位上均有重大意义。而植物间细胞融合所得到杂交细胞，获得了新杂交植物，如西红柿与马铃薯细胞融合获得“西红柿马铃薯”，羽衣甘蓝与白菜型油菜细胞融合得到“甘蓝型油菜”等。2．细胞核移植细胞核移植是将一种动物细胞核移入同种或异种动物去核成熟卵细胞内显微操作技术。由于重要遗传物质存在于细胞核内，因而此技术可获得遗传上具同质性状动物，对动物优良杂交种无性繁殖和濒临绝迹贵重动物传种具备重大意义。1952年，美国科学家布里格斯(R．Briggs)初次运用豹纹蛙卵细胞建立了细胞核移植技术。1981年，瑞士科学家K．111menses率先对哺乳动物小鼠卵细胞进行核移植获得成功。她将灰鼠细胞核注入到除去了精核和卵核黑鼠受精卵内，然后再将这一f'Fh黑鼠细胞质和灰鼠细胞核构成卵细胞体外培养，得到仔鼠是灰色，阐明仔鼠性状取决于细胞核来源。在细胞核移植技术上发展起来动物体细胞克隆技术在1997年因克隆羊“多莉”(Dolly)诞生而获得了重大突破。英国科学家维尔穆特(I．wilmut)等1997年2月27日在《自然》描述了“多莉”克隆过程(图3—27)。她们取出六龄芬兰多塞特白绵羊母羊乳腺细胞核，将此核导入苏格兰黑绵羊去核卵细胞内，待手术完毕之后，以相似频率电脉冲刺激换核卵，让苏格兰黑绵羊卵细胞质与芬兰多塞特白绵羊母羊乳腺细胞核互相协调，使这个“组装”细胞在体外发育成初期胚胎，然后将胚胎植入另一只母羊子宫内，产下了小绵羊“多莉”。“多莉”不是由母羊卵细胞和公羊精细胞受精产物，而是体细胞核加去核卵细胞质，不经两性结合诱导出来胚胎产生。“克隆羊”诞生表白：动物体中执行特殊功能、具备特定形态所谓高度分化细胞与受精卵同样具备发育成完整个体潜在能力。图3—27克隆羊“多莉”诞生过程(引自Glick&Pasternak，1998)1998年，日本科学家运用成年动物体细胞克隆两头牛犊诞生；同年，美国科学家用成年鼠体细胞成功地哺育出了第三代共50多只克隆鼠；1999年，夏威夷大学科学家运用成年鼠体细胞克隆出第一只雄性老鼠；1月，美国科学家宣布克隆猴成功，这只恒河猴被命名为“泰特拉”；同年3月，曾参加克隆小羊“多莉”英国PPL公司宣布，她们成功哺育出5头克隆猪。，国内科学家成功克隆出牛和山羊，使国内成为少数掌握体细胞克隆哺乳动物核心技术国家之一。，美国、意大利等国科学家分别哺育出世界上第一匹克隆骡子和克隆马。中华人民共和国和法国科学家合伙初次克隆出大鼠。(二)蛋白质工程蛋白质工程是依照分子设计方案，通过对天然蛋白质基因进行改造，来实现对其所编码蛋白质改造，它产品已不再是天然蛋白质，而是通过改造，具备了人类所需要特性特殊蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长进化过程自然选取而来，而蛋白质工程对天然蛋白质改造，能更快、更有效地为人类服务。重组人p干扰素(IFNp)人工改造是蛋白质工程一种成功范例。干扰素(interferon)是人体细胞分泌一种蛋白质，具备广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能，是人体防御系统重要构成某些。重组人IFNβ是采用重组DNA技术，克隆人β干扰素基因，构建合成干扰素基因工程菌，经发酵、提纯、纯化制备而成。其基因工程产物活性为10万U/mg，仅是天然IFN口产物活性10%。蛋白质构造分析发现，人IFNβ由154个氨基酸构成，在17、41、141位有3个半胱氨酸(Cys)，人体天然产物在41、141间形成二硫键，基因工程产物二硫键位置有偏差，17位Cys巯基参加二硫键，形成无活性二聚体或寡聚体。由于丝氨酸(Ser)与半胱氨酸在构造上除羟基(-OH)与巯基(-SH)外完全同样，因而将17位Cys点突变为Ser，成果证明人工改造IFN口产物活性提高100倍，稳定性好于天然产物。(三)酶工程酶工程(enzymeengineering)就是通过对酶修饰改造，提高酶催化效率并在某毕生物反映器中大规模生产技术过程，重要涉及酶发酵生产、酶分离纯化、酶分子修饰、酶和细胞固定化、酶反映动力学与反映器、酶应用等。酶工程应用重要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中(表3—4)。例如，固定化青霉素酰化酶用于持续裂解青霉素生产；α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶持续作用于淀粉，就可以生产出各类糖浆；运用葡萄糖苷酶可生产出低糖啤酒；蛋白酶用于除去毛皮中特定蛋白，软化皮革等。加酶洗衣粉、用蛋白酶生产嫩肉粉等，都是酶工程产物。此外，酶工程还用于农副产品加工运用。美国运用大豆生产出200余种产品，涉及营养食品、药物、食品添加剂等，例如高纯度大豆卵磷脂、大豆蛋白等。当前工业生产酶有60余种，其中规模化生产仅20余种。表3—4酶工程重要应用领域应用领域酶类重要用途食品工业淀粉酶类葡萄糖、麦芽糖生产，啤酒酿造，面包、饼干等，烘烤食品制作等蛋白酶类嫩肉粉、饼干、蛋白胨、乳酪生产，啤酒澄清，肉类加工(如香肠熟化等)糖化酶淀粉液化，糊精降解葡萄糖异构酶高果糖浆生产葡萄糖苷酶低糖啤酒生产凝乳酶乳酪生产果胶酶果酒、果汁去浊纺织工业淀粉酶类纺织品褪浆纤维素酶解决纤维制品，提高棉毛纺织品质量蛋白酶类丝制品脱胶解决日化工业蛋白酶类加酶洗涤剂、加酶护肤品与化妆品生产淀粉酶类加酶洗涤剂生产超氧化物歧化酶化妆品生产糖酐酶牙膏添加剂制革工业蛋白酶类皮革去毛、软化医药工业青霉素酰化酶青霉素、头孢霉素生产羟化酶氢化可松生产酪氨酸酶多巴(主治帕金森病)生产蛋白酶类氨基酸、蛋白水解液生产，治疗消化不良，消肿，降压等葡萄糖脑苷酯酶治疗高雪病(葡萄糖脑苷酯酶缺少症)天冬酰胺酶治疗白血病溶菌酶消炎，镇痛，止血等尿激酶治疗心肌梗死、结膜出血等超氧化物歧化酶治疗红斑狼疮、皮肌炎、辐射损伤等链激酶治疗血栓性静脉炎、血肿等其她各种酶各种疾病诊断(如葡萄糖氧化酶诊断糖尿病，胆碱酯酶诊断肝炎等)环保工业淀粉酶类解决造纸工业废水溶菌酶解决高有机物含量废水丁酸梭菌酶系解决酿酒工业废水其她各种酶环境监测试剂(如胆碱酯酶监测有机磷农药，硫氰酸酶监测氰

化物等)(四)发酵工程发酵工程(fermentationengineering)是运用微生物特性，通过当代化工程技术，在反映器中生产目产物或提供所需服务技术过程。“发酵”一词来源于拉丁语动词fervere(发泡)，意指运用酵母以果汁或麦芽汁为原料生产酒精饮料时浮现现象。老式发酵技术有悠久历史，早在几千年前人类就运用有益微生物生产食品和药物，如酒、醋、酱、奶酪等。当代发酵工程是在老式发酵工艺基本上结合基因工程、细胞工程、酶工程等当代高新技术发展而成，由于其重要以微生物培养为主，因而也称微生物工程。发酵工程由3某些构成(图3—28)：上游工程、发酵过程和下游工程。其中上游工程涉及优良菌株选育、最适发酵条件(pH、温度、溶氧和营养构成)拟定、营养物准备等。发酵过程重要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物工艺技术。这里要有严格无菌生长环境，涉及发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌技术，在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气空气过滤技术，在发酵过程中依照细胞生长规定控制加料速度计算机控制技术，尚有种子培养和生产培养不同工艺技术。图3—28发酵工程基本流程微生物发酵产品可分为如下几大类：微生物细胞(生物量)作为产品，如单细胞(酵母)蛋白作为食品或饲料。微生物代谢物产品，当前医用抗生素、农用抗生素等已有近200个品种，绝大某些都是发酵产品。此外，发酵产品还涉及酒精、氨基酸、柠檬酸和工业用酶等。味精、各种维生素等也是发酵工程产品。基因工程产品。微生物(如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌和酵母等)是最惯用重组基因表达系统。重要产品涉及干扰素、胰岛素、牛凝乳酶、G—CSF(粒细胞集落刺激因子)、EPO(红细胞生成素)和tPA(重组组织型纤溶酶原激活剂)等。(五)生物医学工程生物医学工程(biomedicalengineering)是综合生物学、医学和工程学理论和办法而发居起来新兴综合学科。生物医学工程开始以仿生学原理制造人工器官，如心脏起搏器、人造心脏、假肢等，以及用于诊断手段医学仪器。日后人体器官移植成为医疗中可以选取手段，但经常要克服异体器官排斥反映，在用药物可以解决排斥反映之前，人体器官移植成功例子很少。由于生物技术迅猛发展，在DNA双螺旋构造发现50年后，人类基因组筹划已经完毕，对人类基因全面理解后，人们已经将眼光投到干细胞克隆和治疗性克隆(非生殖性克隆)，某些国家如美国建立了胚胎干细胞系，用于涉及治疗性克隆等方面研究。国外已经成功地从自体鼻窿腔内取出干细胞，导人心脏，去除心脏因炎症等留下疤痕，恢复了心脏正常功能，以及用血液中干细胞修复因车祸等导致四肢瘫痪患者脊髓神经，使她们重新站立起来。这是由于即便是成人，某些在胚胎时期存在干细胞仍可以留存在身体各某些，或者作为专能干细胞，也在人体器官中，这些干细胞可以在特定状况下进一步分化为组织。运用自体干细胞也免除了异体器官移植糟糕排斥反映。这种运用人体自身干细胞修复人体受损某些已经成功例子以及治疗性克隆前景，为解除人类病痛带来了福音。(六)生物信息工程生物信息工程(biologicalinformationengineering)可以简朴地定义为计算机与信息技术在生命科学中应用，它是一种年轻和迅速发展领域。生物信息工程运用数学、计算机科学和生物学来阐明和理解大量生物学研究实验数据中所包括生物学意义，涉及此类数据采集、贮存、整顿、归档、分析与可视化等。以人类基因组筹划(humangenomeproject，HGP)为序幕生物信息学研究，是全面结识生命及其过程重要手段，由此引起生物信息革命，将从主线上变化生命科学和生物产业思维方式和研究体系。人类基因图谱绘制既是生物学突破也是计算科学壮举。在生物学家看来，存在于基因组中碱基对序列是宝贵生物信息资源，是将来生物工程产业支柱。人类3万～4万个基因信息以及相应染色体位置被阐明后，将成为医学和生物医药产业知识和技术创新源泉。某些困扰人类健康重要疾病，例如心脑血管疾病、糖尿病、肝病、癌症、老年痴呆症等都与基因关于，可以根据已知基因序列和功能，找出这些基因并针对相应靶位进行药物筛选，并设计新药。究竟，已有1500各种致病基因被标记。信息技术有史以来初次成为推动实验生物学和医学发展重要动力。这一趋势明显地体当前所有与理解疾病起因、新药开发有关核心领域中——基因组学、蛋白质组学以及代谢途径研究等，这些专业研究需要依托强大计算机系统、数据和存储管理系统来完毕大量数据解决工作。而这些对生命研究数据将协助人类解开人体内数以万计蛋白质种类基因编码秘密。此外，运用生物信息工程技术建立动、植物良种及有关有用基因数据库将有助于各种家畜、作物基因改良。四、转基因动物图3—30转基因鼠(引自Griffithsetal，1999)老式家畜改良重要是通过多代选取性交配改良饲养动物遗传性状，如产奶、羊毛品质、生长速度和产蛋率等。在每一轮持续世代中，那些具备优越性状动物可作为选育良种。这种交配、选育方式虽然费时、费力，但却很成功，现今几乎所有家畜都通过这种改良。但是这种办法不能将单一功能基因或基因簇引入高等动物染色体DNA上。通过20世纪80年代不懈努力，借助于受精卵原核显微注射和初期胚胎细胞反转录病毒感染等手段，将基因导入受精卵产生新品种设想已成为现实。动物转基因技术迅速成为研究哺乳动物基因表达和发育有效手段，在建立研究人类疾病动物模式系统中发挥着作用，还可以使动物乳腺分泌具有药用蛋白乳汁，因而浮现了“乳腺生物反映器”。转基因技术在小鼠研究中发展得较为成熟(图3—30)。20世纪80年代以来，已经将几百种基因导入不同品系中。这些研究使人们对基因调控、肿瘤发生、免疫专一性、发育分子遗传学及其她某些基本生物活动过程有了更多理解。转基因小鼠还可作为人类治疗药物检测动物，不同转基因品系可作为研究人类遗传疾病生物医学模型。(一)基因导入动物办法在转基因中，DNA可通过3种方式导入：①反转录病毒介导感染初期胚胎细胞，然后植入雌性动物体内。②显微注射到受精卵内膨大精核(雄性原核)中。③基因工程解决胚胎干细胞，导入一种初期发育胚胎后再植入雌性动物体内。1．反转录病毒载体法图3—31显微注射法进行动物转基因基本过程(引自Glick&Pasternak，1998)在各种基因转移办法中，反转录病毒作为载体可以有效地使转移基因整合到受体细胞基因组中。但是，此类载体只能携带小片段(约8kb)DNA，由于长度限制，这些转移基因也许缺少核心相邻调控序列。使用病毒载体有一种最重要缺陷，虽然这些载体被设计为复制缺陷型，但是用于制备大量载体DNA病毒株基因组可同样进入细胞核。除非采用特殊防止办法，这些辅助病毒会在转基因个体中复制、产生。无论是直接将转基因个体作为食品，还是运用其产物，都应绝对避免病毒污染，因此，反转录病毒介导法很少用于生产经济用途转基因动物。2．DNA显微注射法由于反转录病毒介导法局限性，显微注射DNA成为产生转基因小鼠首选办法。整个过程涉及3个重要环节(图3—31)：①刺激供体雌性鼠超量排卵，以产生足够受精卵用于注射。一方面注射孕马血清，约48h后再注射人绒毛膜促性腺激素，一只超量排卵小鼠可产生大概35颗卵，而不是普通5～10颗卵。②雌鼠通过交配，受精卵从输卵管中洗出。③及时对采集受精卵进行显微注射。注射转移基因普通是线性构造，不采用原核生物载体序列。整个过程看似简朴，但需要一系列实验环节配合，并且成功率最高也只有5%左右，因此必要对大量卵进行注射。例如，经注射卵有66%成活率，成活受精卵25%可正常发育，25%后裔携带转移基因，那么，注射1000个受精卵，才干获得30～50个转基因后裔。并且，DNA在染色体上随机整合，在某些个体中，转移基因由于整合位点不当而不能表达，在某些个体中因拷贝数高而过度表达，这会干扰动物正常生理活动。3．胚胎干细胞法小鼠胚胎发育卵泡阶段细胞在培养基中依然保持分化能力。当把它们重新输回胚胎胚泡后，仍保存着分化成其她细胞(涉及生殖细胞)能力，此类细胞称多能性胚胎干细胞(EScell)。ES细胞在体外培养时可承受转基因操作而不影响其分化多能性。外源基因通过同源重组可特异性整合在ES基因组内一种非必须位点上，构成工程化胚胎干细胞。经体外筛选鉴定、扩大培养后再输回小鼠胚胎胚泡