AllinceUPLC系统使用与维护

UltraPerformanceLC®

实验技术与仪器维护

内容提要对UPLC理念的理解ACQUITYUPLC10年回顾

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详解模块详解与注意事项ACQUITYUPLC®

实验技术要点样品制备及溶剂的选择常见问题的故障排除色谱柱的使用ACQUITYUPLC®

[一种整体技术]UV检测器质谱溶剂管理器样品管理器色谱柱单元ACQUITYUPLC®

彻底的创新超高效液相色谱（UltraPerformanceLC™）是分离科学中的一个全新类别，它给实验室带来了新奇而强大的能力。UPLC™借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。ACQUITYUltraPerformanceLC™系统的整体设计可以控制并优化所有的参数，以充分实现今天实验室中UPLC技术所能带来的任何利益。

2010年推出ACQUITYUPLC

H-Class系统四元溶剂管理器(QSM)样品管理器–流路通过进样针(SM-FTN)色谱柱柱温箱(CH-A)支持所有现有的ACQUITY检测器PDA和PDAeλTUVFLRELSDSQD2和TQD内容提要对UPLC理念的理解ACQUITYUPLC7年回顾

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实验技术要点样品制备及溶剂的选择常见问题的故障排除色谱柱的使用UPLCSolventManagerBSM二元溶剂管理器QSM四元溶剂管理器UPLC溶剂管理器对比ACQUITYUPLCACQUITYUPLCH-ClassBSM二元溶剂管理器QSM四元溶剂管理器溶剂管理器设计二元—2solvents四元—4solvents溶剂总数SolventsA1或A2和B1或B2SolventsA,B,C,D(SolventsD1-6,使用SSV选件)溶剂混合模式高压混合低压混合系统体积<120uL标准配置<400uL标准配置压力/流速性能15,000psi最高到1mL/min9,000psi最高到2mL/min流速范围0.01-2mL/min使用BSM和QSM的一般建议使用高质量的溶剂,缓冲盐和添加剂被Fisher验证过的Optima®

商标的有机溶剂质量是最稳定的使用Milli-Q水(我们使用GradientA-10系统)缓冲液要过滤(0.2

m滤膜)不要阻塞脱气机的排空管路(不要将其放到废液瓶中)使用完缓冲液后要用水将其从系统中冲洗干净(用10-20%有机溶剂的水溶液保存)使用BSM和QSM的一般建议保持全部四路溶剂管路全都灌注过(未使用的管路用10-20%有机溶剂的水溶液灌注)保持柱塞清洗管路是灌注过的(90-95%水)启动仪器之前重新灌注溶剂管路(SysPrep或Start-up)如在低波长下用TFA/ACN梯度最好用100

L混合器查看废液瓶是否已满运行梯度最好从0.1%-99.9%(最大值)如使用己烷/THF做流动相，必须更换兼容性套件：BSM:205000551,QSM:205000661BSM和QSM的常见故障真空脱气机硬件错误DegasservaccumHWerror脱气机真空度达不到既定要求(0.9psia)BSM：反复灌注A1A2,B1B2,StrongWash,WeakWash;确认管路中气泡已完全排出;QSM：反复灌注ABCD及Purge;确认管路中气泡已经完全排出;泵硬件超压PumpHWoverpressure系统压力超过15500psi通常是由于系统堵塞引起的;请拆下色谱柱及柱前的在线过滤器,再尝试开启流速;如仍然出错,则说明系统有堵塞的地方,请联系Waters寻求解决办法;泵复位错误Pumphomingerror重启仪器;若仍然出现,请记录报错信息并联系Waters技术支持;SM和FTN的常见故障样品压力低Samplepressurelow流路压力低于100psi确认Weak/StrongWash溶剂是否足够,反复灌注清洗注射器,排除其中气泡;反复灌注样品注射器,排除其中气泡;观察样品室内进样针,确认是否进样针损坏;样品流路压力超限Samplefluidicshighpressurelimit流路压力高于210psi此常见报错通常由于样品管理器六通阀堵塞引起,建议直接与Waters联系取得支持;Z轴移动硬件错误ZpaxismoveHWfault请先检查样品板是否正确放置;观察进样针有无损坏;若只是进样时出现此报错:请确认工作站上选择的样品板类型是：ANSI-48Vial2MLHolderUPLCSampleManagerSM样品管理器SampleManager-

FlowThroughNeedleUPLC样品管理器对比ACQUITYUPLCACQUITYUPLCH-ClassSampleManagerSampleManager-FTN进样模式满环和部分环方式流路通过针方式支持提前载样和定量环离线最大体积0.1-

10uL标配,最高可达250µL(选用定量环)0.1-10uL标配,最高可达250µL(选用定量环)精度低于1%RSD(10–75%定量环体积,for2-250μL)0.3%RSD,满环方式1%,1-10µL洗针液2种–强洗和弱洗一种交叉污染<0.005%<0.005%进样循环时间<15秒,各次进样之间使用“loadahead”功能<30秒,各次进样之间使用“loadahead”功能进样机制XYZZ’XYZRθUPLCSM进样方式总汇满定量环进样当准度/回收率和精度是主要目标时进样方式的第一选择部分定量环进样–针溢出为宽范围样品提供最好的部分定量环进样准度,精度和线性推荐使用2,5和10µL定量环部分定量环进样是第一选择部分定量环进样–压力辅助当分析时间是主要目标和样品体积有限时当进样体积非常大时推荐使用20和50µL定量环UPLCSM不同进样方式的比较项目满环(FullLoop)部分环针溢出(PLUNO)部分环,压力辅助(PartialLoop,PressureAssist)优点最重现的峰面积进样体积可变只是用户指定的进样体积缺点需要较大的样品体积需要比进样体积多

3uL的样品峰面积重现性最小样品耗用环体积

x溢出因子(OverFilles)用户指定的进样体积

+3uL的样品只是用户指定的进样体积适用的定量环可用于所有的定量环适用于

2-10uL的定量环适用于

20到50uL定量环,不推荐用于小定量环适用的进样体积100%环体积,最少:3X前后各4uL(默认值)进样体积:25-75%环体积

对于某一固定的定量环设计,部分定量环进样模式的准度和回收率取决于体积参数/范围以确保最大准确度/回收率推荐的定量环和进样体积定量环进样体积范围样品进样体积(µL)定量环体积部分定量环方式2µL5µL10µL20µL针溢出进样范围(µL)0.2–1.50.5-3.81.0-7.52.0–15.0压力辅助进样范围(µL)N.R.N.R.2.0–5.02.0-10.0满定量环方式2µL5µL10µL20µL压力辅助进样范围(µL)251020标准

R2>0.999面积%RSD<±1.0使用SM的一般建议使用缺省条件–10Lloop和PLUNO(PartialLoopUses

Needle

Overfill,部分定量环使用针溢出)进样方式,在适合2.1x50和2.1x100mmACQUITY柱的进样体积范围内将得到良好的峰形,良好的回收率,良好的线性对于每一种进样方式和定量环,保持在推荐的限度以内若对最佳精密度和最佳准确度有严格要求时,使用满环进样(FullLoop)当需严格控制样品量消耗时,使用PartialLoop(压力辅助)进样方式使用SM的一般建议当循环周期成为一个问题时,使用提前进样(LoadAhead)方式当更换过弱洗针溶剂以及定量环和进样针时,要重新校正针和定量环体积WeakWash溶剂尽量趋同于色谱方法(梯度方法)首行,但不使用缓冲盐溶液对于样品板上覆盖有盖垫(capmat)时,使用带不锈钢针尖的针总是使用柱热稳定器(即使不使用柱温)使用FTN的一般建议使用90:10=乙腈:水作为WashSolvent(强洗)溶剂使用10:90=乙腈:水作为PurgeSolvent(弱洗)溶剂工作站中标配的样品盘类型的选择必须为：ANSI-48Vial2mlHolder更换定量环的注意事项正确固定定量环并确保环接头正确插入六通阀的端口在上紧压紧螺丝之前,确认没有产生死体积每一个定量环接入六通阀的接口要专用(按第一次连接的位置连接)将定量环的接头管路与六通阀连接的位置做标记正确选用与定量环大小相关的适用的进样方式UPLCDetectorsPDADetectorTUVDetectorFLRDetectorELSDetectorRIDetectorTUVDetector可变波长紫外检测器原理：通过测定样品在流通池中吸收紫外可见光的大小来确定样品的含量；TUVDetector可变波长紫外检测器光源：氘灯(2000H/购买之日起一年)波长范围：190-700nm波长准确度：±1.0nm常用采集速率：20HZ(单通道)/2HZ(双通道)流通池最大耐压：69bar，1000psi为正确校准检测器，必须在开启检测器电源之前使流通池充满流动的溶剂。空流通池可能导致校正错误；PDADetector二极管阵列检测器原理：二极管阵列检测器和普通紫外检测器在根本原理上是一样的，但是其得到的结果完全不同；二极管阵列检测器可以得到某一波长范围内所有波长的色谱图；

PDADetector二极管阵列检测器光源：氘灯(2000H/购买之日起一年)波长范围：190-500nm/190-800nm（eλPDA）波长准确度：±1.0nm采集速率：20HZ（常用）流通池最大耐压：69bar，1000psi为确保流通池具有最佳性能，洗脱液必须处于流动状态后再接通检测器电源！启动TUV(PDA)检测器确保检测池中充满溶剂并且没有气泡.如果检测池中有

气泡,检测器就不能很好的初始化,并有可能损坏检测池建议在泵灌注后,用流动相冲洗流通池10分钟后再打开检测器电源检测器初始化大概需要2分钟,灯预热大概需要3分钟当指示灯常绿不闪烁时,通过控制台做”Reset”来连接检测器要得到好的数据，需要30分钟的时间平衡检测器和稳定基线FLRDetector荧光检测器原理：某些化合物吸收特定波长的光而跃升到更高的能量状态时，会发生荧光现象；而测定发出的荧光能量即可定量；FLRDetector荧光检测器光源：氙灯(1000H/购买之日起一年)激发(Ex)波长范围：200-890nm发射(Em)波长范围：210-900nm波长准确度：±3.0nm采集速率：20HZ(常用)增益(GAIN)：1.0(常用)流通池最大耐压：34bar，500psiWaters荧光检测器可进行λ-λ扫描：指定激发波长范围内扫描指定的发射波长范围；对于未知样品的分析提供了极大的帮助！若使用紫外检测器与荧光检测器串联，请务必将荧光检测器接在紫外检测器后，以避免过大的反压碎坏流通池！ELSDetector蒸发光散射检测器原理：雾化来自液相色谱系统的溶剂，并将产生的液滴夹杂在气流中。流动相从液滴中蒸发出来而分析物的挥发性低于流动相，它作为溶质颗粒留在气流中并到大达ELS检测器；颗粒使光束发生散射。散射光的量可以测量出来，并且与洗脱物质的浓度有关；ELSDetector蒸发光散射检测器光源：钨灯(2000H/购买之日起一年)漂移管温度范围：0-100°C,50°C(常用)喷雾器加热功率:0-100%及冷却模式气体压力范围：20-60PSI,40PSI(常用)采集速率：10HZ(常用)增益GAIN：500(常用)ELSD需要恒定(表头压力4.5到6.9bar或65到100psi)干燥、无油经过滤的氮气(或零级无油的、经过滤的空气);要操作ELSD，请先打开气体，再开启检测器电源！待漂移管温度及喷雾器功率都稳定后，再开启流速；关闭检测器时，请先排除检测器内的所有缓冲盐溶液；先将泵流速关闭并让雾化气体通过检测器至少10分钟，以排干漂移管及检测室！最后关气及关电源；RIDetector示差折光检测器原理：示差折光检测器是通过连续测定色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进行检测的。溶有样品的流动相和流动相本身之间折射率之差反映了样品在流动相中的浓度；RIDetector示差折光检测器光源:

870nm红外LED灯(2000H/购买之日起一年)检测器内部温控范围:30-55ºC,软件上最高：50ºC流通池最大耐压:10.0bar,145psi采集速率:10pt/s(常用)使用RID，应确保溶剂预先混合并脱气，以避免基线波动或漂移；开机后，首先冲洗清除流路，以确保参比及样品池内是同种溶剂；同时，应在检测器内部温度达到稳定后再开始采集数据(温度的变化会引起折光率的改变)；若一个系统中有多个检测器，必须将示差折光检测器连接于所有检测器之后；使用不稳定的THF时，请确保它是新鲜的。先前打开过的THF容器含有过氧化物杂质，将导致基线漂移；检测器常见故障TUV及PDA点灯失败Lamplightingfailure重启检测器电源更换新的氘灯光闸复位错误Shuttercouldnothome以水或甲醇冲洗流通池半小时后再开机更换新的氘灯以尝试是否能解决波长检验失败Calibrationunsuccessful在控制台中检查参比和样品能量，若样品能量过低请先用透明溶剂清洗流通池联系Waters客服热线寻求解决！TEL：8008202676检测器常见故障FLR点灯失败Lamplightingfailure重启检测器电源更换新的氙灯校正数据丢失，PMT未校正calibrationnotfound,pmtnotcalibrated多数是CPU电池没电，联系Waters获取技术支持进样后出现很大的负峰Signaltoohigh样品浓度过高，稀释样品后再试波长检验失败

Calibrationdiffers:n.nnm开机自检的时候波长误差超过2nm，一般流通池有污染会出现这种状况，建议先冲洗流通池检测器常见故障ELSD及RIDLED灵敏度过高/过低LEDIntensitytoohigh/toolow参比池及样品池溶剂差异过大，持续灌注清除流路RAM丢失Non-volatileRAMCorrupted通常是CPU电源板上电池没电，联系Waters获取技术支持内容提要对UPLC理念的理解ACQUITYUPLC7年回顾

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实验技术要点样品制备及溶剂的选择常见问题的故障排除色谱柱的使用容器使用通则总是使用清洁的玻璃器皿(瓶子,量筒或溶剂过滤装置),并在用前冲洗干净尽量保持一组溶剂瓶和玻璃器皿专用于ACQUITYUPLC系统决不要用其他实验室(例如微生物实验室等)的玻璃器具来冲洗UPLC的玻璃容器溶剂瓶要贴上注明流动相配制日期的标签不要往系统上的流动相瓶中“添加”流动相每24-48小时制备新鲜的水相流动相,尤其是100%含水流动相系统上的溶剂瓶要用合适的瓶盖盖好用铝箔密封溶剂瓶口注意:不要使用PARAFILM®(石蜡膜)或其它塑料膜来密封溶剂瓶口控制水相流动相长菌流动相A组成:0.1%HCOOH配制时间:Sep17,1937您的流动相看起来是这样吗?这种吃藻类的细枝鲶鱼似乎是下一个产品?UPLC流动相过滤膜的选用推荐使用:WatersP/N:1860035240.2um47mmGHPWatersP/N:WAT2005310.2um47mmPVDF避免使用:尼龙材料的膜和聚醚砜材料的膜,例如:Supor-200filter使用Supor-200filter过滤流动相,可能会对UPLC色谱柱造成污染.对污染的UPLC色谱柱入口出口筛板进行分析发现,入口筛板处被一层主要含N,S,O的物质所覆盖,经红外显微鉴定该物质为聚砜.而Supor-200filter正是由聚醚砜构成的.推荐的溶剂/样品稀释剂甲醇超纯水乙腈异丙醇乙醇二甲基亚砜N,N-二甲基甲酰胺不建议使用的溶剂/样品稀释剂氯仿乙酸乙酯含卤素溶剂类(例如三氯苯,二氯甲烷)过氧化物甲苯>5%的强酸包含EDTA等高浓度螯合剂的溶液推荐使用的添加剂/改性剂0.2%甲酸0.1%TEA10mM磷酸盐缓冲液50mM铵缓冲盐0.1%EDTA0.1%TFA0.1%七氟丁酸10mM碳酸氢铵50mM乙酸铵样品制备应注意的问题标样和样品标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参考标准物,

一般是纯度较高的纯物质样品:待测物,一般是成分复杂的混合物液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:必须能溶于流动相如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样时样品在流动相中析出堵塞管路和色谱柱样品溶液要过滤除去微粒及杂质了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用选择适合的UPLC样品瓶样品瓶是UPLC分析中易被忽视的地方使用不当往往会使SM出现进样针故障是造成定量不准的重要因素是色谱图质量不佳的影响因素提示:测试样品与样品瓶的兼容性某些化合物可能会与样品瓶作用，或者吸附在样品瓶表面选择适合的瓶盖－减小污染螺纹盖传统型盖与垫分离(装时可能带来污染)

LectraBondTM盖垫一体，不使用化学剂和粘合剂（电子焊接法）－更小的污染可能有预开口设计内容提要对UPLC理念的理解ACQUITYUPLC7年回顾

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实验技术要点样品制备及溶剂的选择常见问题的故障排除色谱柱的使用系统压力问题系统压力是色谱系统正常与否的一个提示系统压力受色谱柱长度,内径,柱温,流动相组成及流速等多重因素影响,需要操作者养成记录的习惯系统压力过低,一般与漏液或流动相走干有关。应依次检查泵头周围,SealWash管路,六通阀接口,色谱柱接头等容易漏液的地方。并用纯甲醇充分灌注系统，以排除管路中气泡的影响系统压力问题系统压力过高,则与管路不畅,在线过滤器筛板堵塞有关,正常情况下,过滤器筛板反压在BSM系统上不超过100psi,在QSM系统上不超过300psi,过高则需更换或清洗系统压力也与色谱柱筛板堵塞相关，此时需更换色谱柱筛板，更换方法见后系统压力波动,则多与系统未平衡,管路中有气泡以及柱温的变化有关；应灌注系统排除气泡,充分平衡方法,检查柱温的设置及是否有微渗的地方,并留意系统脱气机的压力显示：BSMDegasser<0.9psiaQSMDegasser<1.2psia进样器污染的问题(1)检查进样针是否弯曲稀释液与洗针液是否互溶检查强洗针溶剂可以试试70:20:10甲醇/水/异丙醇也许听说过“奇妙洗液(WonderWash)”甲醇,乙腈,水,异丙醇各25%确保使用了合适量的弱洗针溶液,这样就没有强洗针溶剂残留在管线中以至于影响到下一针进样能观测到靠前洗脱的峰保留时间漂移和峰形变差就表明弱洗针液的量不够可能造成污染的因素(2)确保总是运行了空白并已排除以下因素…样品瓶污染流动相使用了不好的水或是有其它污染物在溶剂中如果仍不奏效,检查样品管理器的“清洗站(washstation)”的针密封,如有必要进行更换

很多情况下并非系统问题,往往来自样品制备的过程!!!!(~60%的情况如此!)可能造成污染的因素(3)可能来自定量环的交叉污染如果要移除一个定量环然后反向安装在了阀上,色谱性能可能没什么不同,但是定量环里会有一些能隐藏污染物的空隙满定量环进样同时满定量环进空白溶液观察交叉污染如果没有交叉污染,那么不是定量环的原因,反回头来查找NeedleSeal的原因如果有交叉污染,那么安装新的定量环通讯问题控制台上提示通讯失败？进样之后没有数据采集？下面将介绍出现通讯问题后的解决办法！通讯问题打开Empower软件配置系统节点属性检查各个模块的状态通讯问题部分模块通讯不正常？检查此模块电源是否开启？软件或硬件上是否有此模块报错信息？此模块背后的网线是否正确连接？所有模块都通讯不正常？检查所有模块电源是否开启？交换机电源是否正常？网线是否正确连接到PC？电脑的本地连接IP地址是否正确？InstrumentLANIPAddress：192.168.0.1/172.16.0.1通讯问题-部分模块通讯不正常？检查模块电源是否正常，指示灯是否常绿？指示灯不亮，请尝试重启模块，并确定模块背后的电源线及插头是插紧的；指示灯亮红，应有硬件故障；请读取报错信息，必要时联系Waters取得支持；检查模块背后网线连接是否正常？请检查模块背后的网线是否插紧？是否连接在正确的位置？如发现异常，可尝试重新拔插网线或更换网线；UPLC系统的交换机一般安装在样品管理器或柱温箱背后！通讯问题-部分模块通讯不正常？打开Empower软件，进入节点属性-配置DHCP，记录通讯错误的模块IP地址；通讯问题-部分模块通讯不正常？在Windows系统中尝试ping此IP地址点击开始菜单在运行框内输入”cmd”在弹出的DOS界面输入：Ping192.168.0.X若提示请求超时：请再次检查仪器状态，网线连接；可以尝试重启仪器及计算机；或联系Waters得到技术支持；若提示回复正常：请检查当前运行的色谱系统是否选择正确，亦可尝试重启计算机；通讯问题-全部模块通讯不正常？首先确认所有模块均已正常启动；接下来请检查计算机IP地址是否设置正确；打开Windows”网络和共享中心”打开本地连接属性双击”TCP/IPV4”检查IP地址注意：”网络及共享中心”通常有至少两个”本地连接”；请务必先确定好仪器占用的是哪个本地连接，再做后续检查！通讯问题-全部模块通讯不正常？确认IP地址无误后，可以尝试拔插/更换交换机至计算机的网线，并重启仪器及计算机；使用外置交换机时，请检查交换机电源！注意：UPLC交换机通常内置在样品管理器/柱温箱，无法直接做检查；如怀疑交换机故障，请联系Waters取得更多的技术支持；安装了Empower工作站的计算机，防火墙及自动更新均应处在关闭状态！电源计划应使计算机从不自动进入休眠模式！联系Waters客服热线寻求支持！TEL：8008202676内容提要对UPLC理念的理解ACQUITYUPLC7年回顾要点:如何实现小颗粒填料的益处ACQUITYUPLC®

实验技术要点样品制备及溶剂的选择常见问题的故障排除色谱柱的使用关于柱效或塔板数塔板数是综合反映色谱柱和仪器性能的关键指标塔板数取决于下列两个参数:保留时间峰宽窄峰高塔板数峰形越均匀塔板数越高分析型HPLC典型的塔板数值(5)约为100,000/米UPLC典型的塔板数值(5)

高达200,000/米塔板数值塔板数值受下列因素影响:机械因素仪器联接(端口接头,锥箍)柱装填的好坏化学因素色谱因素(溶剂)填料的生产制造质量防止色谱柱污染

-微生物污染(最为常见)从柱子入口处取下筛板(紧靠柱床一侧)上棒状细菌的电子显微镜图还可观察到有机聚合物防止色谱柱污染

-缓冲盐污染从柱子出口处取下的筛板(紧靠柱床一侧)上,沉淀物(磷酸盐?)的电子显微镜图正确使用色谱柱(一)样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如溶样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质/填料是否有相互作用正确使用色谱柱（二）流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度有机溶剂：色谱纯,杂质含量尽量低,并与填料相匹配流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例正确使用色谱柱（三）存放方面存放前的处理－除去杂质、缓冲盐防止细菌生长合适的存放溶剂能有效避免色谱柱床干涸避免机械震动注意存放温度ACQUITYUPLC色谱柱清洗程序极性样品非极性样品蛋白样品1.水1.异丙醇(或合适的异丙醇/水混和溶液)1.重复进样少量二甲基亚砜2.甲醇2.四氢呋喃2.梯度洗脱从10%到90%的B;A:0.1%三氟醋酸水液;B:0.1%三氟醋酸乙腈溶液3.四氢呋喃3.二氯甲烷4.甲醇4.正己烷5.水5.异丙醇(接着用合适比例的异丙醇/水混和溶液)3.用7mM的盐酸胍或是7mM的尿素冲洗6.流动相6.流动相注:用低的有机溶剂组成清洗色谱柱以避免缓冲盐沉淀柱筛板ACQUITYUPLC™柱筛板更换程序简单,然而是用以判断色谱柱堵塞部位(不是来源)的有价值的诊断方法证明填充床并不是问题所在有助于使用户确信是某种东西堵塞