临床免疫学检验：第八章 酶免疫技术

第八章酶免疫技术放射免疫技术发光免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术三大经典标记技术

第一节酶免疫技术的特点

是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。酶免疫技术概念：能定性、定位、定量主要试剂:

酶标记的抗体或抗原酶结合物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性酶高效催化反应的专一性基本原理

＋Ag

-Ab-E(Ag-E-Ab)

S显色反应Ag(Ab)定性、定量、定位分析基本原理Ab-E(Ag-E)

+

Ag(Ab)灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法特点

标记酶的要求：

活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉

一、酶和酶作用底物糖蛋白（主酶）：与酶活性无关亚铁血红素（辅基）：酶的活性基团常用酶及底物1、辣根过氧化物酶（HRP）来源：辣根分子量小(44KD)，易穿透细胞内部；等电点pH7.2，63℃加热15min稳定；叠氮钠、氰化物、氟化物、强酸可使HRP灭活。酶纯度（RZ）=A403nm/A275nm≥3.0RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要ELISA中应用最广的标记酶DH2+H2O2→D+2H2OHRP供氢体底物：邻苯二胺（OPD）：橙黄色→棕黄色492nm

四甲基联苯胺（TMB）：蓝色→黄色，450nm

最常用

受氢体：

专一性高，过氧化物（H2O2，醇过氧化物，尿素过氧化物）HRP底物HRP常用的供氢体底物及其反应产物供氢体底物反应产物终止剂测读波长二氨基联苯胺(diamido-benzidine,DAB)棕色、不溶性2mol/LHCL或H2SO4492nm联苯胺(benzidine)蓝色、不溶性450nm邻苯二胺(o-phenylenediamin,OPD)黄色、可溶性同上492nm四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethyl-benzidine,TMB)蓝色(黄色)、可溶性同上450nm5-氨基水杨酸(5-aminosalicylicacid,5-ASA)棕色、可溶性3mol/LNaOH550nmABTS(2,2-azino-bis(3-ethylbenzithiazoline-6-sulfonicacd)绿色、可溶性1%SDS405nm注：括号内为终止后的显色及测读波长碱性磷酸酶（ALP）：菌源性ALP（80KD,最适pH8.0）肠粘膜ALP(100KD,最适pH9.6）对-硝基苯磷酸酯（pNPP）→对硝基酚（黄色）→405nmALPELISA中禁止使用磷酸盐缓冲液2、碱性磷酸酶（ALP）NaOH3、β–半乳糖苷酶（β-Gal）血标本中缺乏，不易受内源性酶的干扰，用于均相酶免疫测定4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷（4MUG）→4MUβ-Gal360nm

激发光450nm荧光酶免疫技术的核心组成部分

二、酶标记抗体或抗原酶结合物（conjugate）/酶标记物：

通过化学反应将酶与抗体或抗原形成的结合物

抗原要求纯度高，抗原性完整

抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不形成聚合物制备方法要求直接法：酶分子中的多糖羟基被过碘酸钠氧化为醛基后再与抗原或抗体分子的氨基结合

改良过碘酸钠法

HRP标记最常用的方法

交联法：具有双功能或多功能化学基团的交联剂为桥，分别与酶和抗体（抗原)结合。

戊二醛交联法HRP、AP的标记

制备方法酶结合物的纯化葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶结合物的鉴定质量鉴定：酶活性、抗体（抗原）的免疫活性酶标记率的测定酶量：1mg/mlHRP/IgG：1.5~2.0酶的标记率>0.3塑料：聚苯乙烯（最常用）(小珠、小试管、微量反应板)

聚氯乙烯微粒：需特殊的仪器膜载体：硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃纤维素膜固相抗体或抗原：把抗体或抗原结合到固相载体的表面三、固相载体包被(coating)：将抗原或抗体结合于固相载体上的过程封闭(blocking)：用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异吸附。包被与封闭(pH9.6碳酸盐缓冲液)酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相

异相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位

液体标本中抗原或抗体的定性和定量第二节酶免疫技术分类用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定

利用酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。一、均相酶免疫测定酶放大免疫分析技术（EMIT）

enzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、溶菌酶

注意点!1.Ag－E—Ab:酶活性↓（∵Ab的空间位阻，影响酶活性中心）2.游离酶(Ag-E)有酶活性EMITEMIT

基本原理:

＋

Ag(待测）竞争

Ab（限量）Ag-E当Ag多时Ag-Ab

(多)Ag-E

–Ab＋Ag-E(少)（多）酶活性↑S当Ag少时Ag-Ab(少)Ag-E

–Ab＋Ag-E

(多)（少）酶活性↓酶活性与待测Ag含量呈正相关克隆酶供体免疫分析（CEDIA）

clonedenzymedonorimmunoassayβ-D-半乳糖苷酶CEDIA：注意点!2.形成Ag-ED—Ab时，Ab阻止ED与EA结合,酶活性↓

EAEDAgEDAg抗体活性酶1.酶EA(大)ED(小)

单独无活性，结合为全酶方具活性

EAED

EAED3.结合力:Ag与Ab＞EA与EDCEDIA原理示意图：

EA

EAED活性酶AgEDAg抗体EDAg抗体抗体AgAg

EACEDIA基本原理：Ag（待测）竞争EAAbAg-ED（限量）Ag多Ag－Ab（多）＋

Ag-ED－

Ab（少）Ag-ED（多）EAAg-ED－EA（多）（酶活性↑）SAg少Ag－Ab（少）＋

Ag-ED－Ab（多）Ag-ED（少）

EAAg-ED－EA（少）（酶活性↓）S酶活性与待测Ag含量呈正相关分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定

与均相不同之处：需分离游离与结合的酶标记物二、异相酶免疫测定

第三节酶联免疫吸附试验

enzyme-linkedimmunosorbentassay（ELISA）

一、基本原理二、方法类型及反应原理三个必要试剂固相的抗原或抗体酶标记物（酶结合物）酶反应的底物

夹心法间接法竞争法捕获法ABS-ELISA双抗体夹心法双抗原夹心法三大基本方法1、双抗体夹心法测抗原最常用的方法二价及二价以上的大分子抗原ELISA检测抗原的方法1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYYEEEEEEEEELISA结果：阳性阴性空白注意标本中类风湿因子的干扰2、双位点一步法选择针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体钩状效应（hookeffect）：双位点一步法中，当标本中的待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而抑制夹心复合物的形成，显色降低，使最终测定结果低于实际含量，严重时可出现假阴性结果。洗涤洗涤3、竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用的底物不显色或显色弱3、加酶作用的底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE测小分子抗原或半抗原EEEEEEEE1、间接法（最常用）原理：酶标记的抗抗体（酶标二抗）检测与固相抗原结合的受检抗体酶标抗人Ig测总抗体酶标抗人IgG测IgG类抗体酶标抗人IgM测IgM类抗体只需更换固相抗原，可用一种酶标二抗检测标本中多种针对不同抗原的抗体标本需稀释ELISA检测抗体的方法1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYYYYYYYEYYYYYYYY+EEEEEEEEE2、双抗原夹心法反应模式与双抗体夹心法类似用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同：以酶标抗原代替酶标抗抗体。3、竞争法原理：类似检测抗原的竞争法

应用：HBcAb、HBeAb的检测YYYEYEYEY待测HBcAb酶标HBcAb温育、洗板YEYY温育加入酶作用的底物YEYY显色的强弱与待测标本中的HBcAb的含量成反比固相HBcAg竞争法测HBcAbEEEEEYYYEYEYEY待测HBeAb酶标HBeAb温育洗板加入酶作用的底物显色的强弱与待测标本中的HBeAb的含量成反比固相HBeAb竞争法测HBeAbYYY中和抗原HBeAgYYY温育洗板YYYEYEY温育YYYEYEYEEEEEEE4、捕获法

测IgM类抗体常用于测定病原体急性感染诊断中的IgM型抗体抗人IgMμ链抗体样本（IgM1、2）抗人IgMμ链抗体IgM1特异抗原（Ag1）抗人IgMμ链抗体抗人IgMμ链抗