遗传病的诊疗专业知识培训专家讲座

DiagnosisofGeneticDisease第17章遗传病诊疗遗传病的诊疗专业知识培训第1页[教学要求]

1．遗传病临床诊疗：病史采集；症状和体征；系谱分析。2．细胞遗传学检验：染色体检验，FISH技术；性染色质检验。3．生化检验：代谢产物分析、酶和蛋白质分析。4．基因诊疗：基因诊疗定义和特点；基因诊疗方法：限制性片段长度多态性分析、Southern印迹杂交、聚合酶链反应分析（已知点突变检测、未知点突变检测、基因缺失检测、RCR-RFLP）、DNA测序、DNA芯片、荧光原位杂交等原理、操作和应用。遗传病的诊疗专业知识培训第2页产前诊疗(prenataldiagnosis)

植入前诊疗(preimplantationdiagnosis)症状前诊疗(presymptomaticdiagnosis)现症病人诊疗(symptomaticdiagnosis)遗传病的诊疗专业知识培训第3页临床诊疗试验诊疗病史采集症状和体征遗传病系谱分析细胞遗传学检验生化检验基因诊疗遗传病的诊疗专业知识培训第4页第一节遗传病临床诊疗1

症状和体征

2

系谱分析

3病史采集遗传病的诊疗专业知识培训第5页一、病史采集家族史：有没有同种病史；

婚姻史：婚龄、婚次、配偶健康情况及是否近亲结婚；

生育史：生育年纪、生育儿女数目及健康情况，有没有流产、死产和早产史。除应了解普通病史外，还应着重采集与遗传病家族聚集现象相关以下项目：遗传病的诊疗专业知识培训第6页二、症状和体征遗传病有和其它疾病相同症状和体征，往往又有其本身特异性症侯群，为诊疗提供初步线索。如：①智力发育不全伴有特殊腐臭尿液苯丙酮尿症②智力发育不全伴有白内障，肝硬化半乳糖血症③智力低下伴有眼距宽、眼裂小、外眼角上斜先天愚型遗传病的诊疗专业知识培训第7页二、症状和体征白化病

并指

多指软骨发育不全遗传病的诊疗专业知识培训第8页二、症状和体征

除了解现在症状和体征外，还应注意了解身体发育快慢、智力促进情况、性器官及第二性征发育状态等。皮肤纹理特征检验也可作为遗传病辅助诊疗指标。

遗传病的诊疗专业知识培训第9页三、系谱分析

12

1234

1ⅠⅡⅢ统计遗传病家族史最好方法是绘制系谱。系谱分析意义①有效统计遗传病家族史②确定遗传病遗传方式③遗传咨询中个体患病风险计算④基因定位中连锁分析遗传病的诊疗专业知识培训第10页系统性、完整性和可靠性不规则显性、延迟显性、从性显性等特殊现象新基因突变显性与隐性概念相对性

注意问题

123

123

12312ⅠⅡⅢⅣ

12345ⅠⅡⅢ

12

1234042452132

12

12341ⅠⅡⅢ同一遗传病采取观察指标不一样而得出不一样遗传方式，如镰状细胞贫血和镰状细胞症状。遗传病的诊疗专业知识培训第11页四、遗传数据库资源应用

OMIM(OnlineMendelianInheritanceinMan)

遗传病的诊疗专业知识培训第12页四、遗传数据库资源应用

OMIM(OnlineMendelianInheritanceinMan)

遗传病的诊疗专业知识培训第13页第二节细胞遗传学检验1性染色质检验

2染色体检验遗传病的诊疗专业知识培训第14页取材：视检验对象和目标而有所不一样，通常主要取自外周血、皮肤、骨髓、胸、腹水、绒毛、羊水中胎儿脱落细胞和脐血等各种组织。体外细胞培养制片：秋水仙素处理，收获细胞、低渗、固定、滴片等过程，制备染色体标本。显带核型分析一、染色体检验遗传病的诊疗专业知识培训第15页①不明原因智力发育不全、生长迟缓者；②先天性畸形（包含两性内外生殖畸形）；③性征发育异常及生育异常：原发性闭经和女性不孕症；无精子症和男性不育症；有重复屡次早期流产史妇女及其丈夫；④家族史：家族中有染色体异常或先天畸形个体。⑤有较长时间、较大剂量射线或致畸致突变物质接触者；⑥恶性肿瘤，尤其是恶性血液病患者。染色体检验（核型分析）指征遗传病的诊疗专业知识培训第16页二、性染色质检验

X染色质和Y染色质适应症：两性畸形或性染色体数目异常疾病诊疗，但仍需染色体检验确认。遗传病的诊疗专业知识培训第17页第三节

生物化学检验1、代谢产物分析

2、酶和蛋白质分析

材料主要起源于血液和特定组织、细胞，如肝细胞、皮肤成纤维细胞、肾、肠粘膜细胞等。产前诊疗中常采集绒毛、羊水、脐带血和皮肤。新生儿筛查最惯用标本是血和尿。遗传病的诊疗专业知识培训第18页苯丙酮尿症,PKUⅠ酶活性检验PAH肝脏血液滤片苯丙氨酸

血FeCl3显色反应----绿色苯丙酮酸尿液例：遗传病的诊疗专业知识培训第19页

1978年，美国科学院院士美籍华裔科学家YWKan(简悦威

)和Dozy应用液相DNA分子杂交成功地进行了镰状细胞贫血症基因诊疗，标志着检验诊疗进入基因诊疗时代。第四节

基因诊疗(genediagnosis)20遗传病的诊疗专业知识培训第20页第四节

基因诊疗(genediagnosis)

基因诊疗：利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测分析致病基因存在、变异和表示状态从而对疾病作出诊疗技术。一、基因诊疗定义和特点A、特异性强B、灵敏度高特点C、应用范围广D、早期诊疗遗传病的诊疗专业知识培训第21页基因诊疗概述人类基因组计划——基因结构后基因组计划——基因功效基因诊疗两个支点：遗传病的诊疗专业知识培训第22页基因诊疗普通流程前提条件：先证者要有明确临床诊疗医学遗传咨询门诊相关临床科室医生诊疗签署基因诊疗知情同意书

抽取外周血2-3ml

基因检测咨询临床医生遗传病的诊疗专业知识培训第23页对基因检测结果了解找到功效性突变：支持临床诊疗未找到功效性突变：不否定临床诊疗遗传病的诊疗专业知识培训第24页遗传病基因诊疗分类临症诊疗——家系先证者或患者症状前诊疗——家系高危个体产前诊疗——家系高危胎儿遗传病的诊疗专业知识培训第25页二、基因诊疗基本方法1．Southern印迹杂交

2．聚合酶链反应分析

3．DNA测序5．荧光原位杂交

4.DNA芯片遗传病的诊疗专业知识培训第26页分子印迹杂交(Southernblotting)基本方法：DNA标本用限制性内切酶消化→琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段→DNA转印至硝酸纤维素滤膜→标识探针杂交→显影→确定探针互补每条DNA带位置，以确定在众多酶解产物中含某一特定序列DNA片段位置和大小。

1．Southern印迹杂交

-+遗传病的诊疗专业知识培训第27页2．聚合酶链反应分析

PCR原理示意图

变性→退火→延伸聚合酶链反应（Polymerase

Chain

Reaction，PCR）：体外酶促扩增特定DNA片段技术。由高温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目标DNA得以快速扩增。遗传病的诊疗专业知识培训第28页（1）产物探针检测

——ASO探针

等位特异性寡核苷酸(allele-specificoligonucleotide，ASO)探针:当某一致病基因突变位点性质以及突变位点两侧碱基序列都明确情形下，能够合成ASO探针。ASO探针检测镰状细胞突变基因示意图正常探针突变探针

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

123已知点突变遗传病的诊疗专业知识培训第29页（2）产物构象改变检测-SSCPDNA单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphisms,SSCP)：相同长度单链DNA可因碱基序列不一样产生构象差异，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为迁移率差异。提取DNA→PCR扩增→产物变性→电泳依据单链条带位置改变判断该个体是否存在突变。并不是全部碱基突变都会造成SSCP，所以该方法不能判别全部突变。

SSCP电泳检测示意图

未知点突变遗传病的诊疗专业知识培训第30页基因缺失时可造成靶DNA模板缺失，使用特异性引物扩增时得不到对应扩增产物，所以能够直接检测缺失。

（3）PCR产物有没有检测正常基因异常基因E1E2E3E4E5E1E2E4E5L1L2L1目标基因引物PCR产物（电泳）L2基因缺失或点突变遗传病的诊疗专业知识培训第31页RFLP连锁分析法（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）

因为碱基变异可能造成限制酶切点消失或新酶切位点出现，引发不一样个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不一样长度DNA片段，称RFLP。（4）产物酶切检测-RFLP基因缺失或点突变遗传病的诊疗专业知识培训第32页RFLP主要步骤:

DNA→酶切→Southern印记杂交分析DNA→PCR→酶切→电泳分析

RFLP主要有以下两种类型：

点多态性序列多态性

遗传病的诊疗专业知识培训第33页正常人（HbA）和镰状细胞贫血患者（HbS）β珠蛋白基因结构差异

正常人（HbA）和镰状细胞细胞贫血患者（HbS）β珠蛋白基因DdeⅠ限制酶切点示意图β珠蛋白基因DdeⅠ限制酶切片段电泳结果例1:镰状细胞贫血遗传病的诊疗专业知识培训第34页

1

2

1

5‘3’16p13.2-pter人类α珠蛋白基因簇例2a地中海贫血缺失基因检测L1L2BamH1BamH114kb遗传病的诊疗专业知识培训第35页

PCR-RFLP检测基因缺失和插入示意图

10kb14kb18kb遗传病的诊疗专业知识培训第36页案例9-2基因诊疗分析(P99)

地贫基因缺失RFLP基因诊疗Ⅰ2正常对照ⅠⅡ12110kb14kb18kbaa/aa

Ⅰ1Ⅱ1aa/a-

aa/--

a-/--

遗传病的诊疗专业知识培训第37页3．DNA测序DNA测序即测定DNA一级结构中碱基次序。包含特定位点PCR产物再作DNA测序，比较正常基因与突变序列，可检测出突变碱基类型和位点。遗传病的诊疗专业知识培训第38页DNA自动测序仪生成序列DNA自动测序仪采取4种不一样颜色荧光分别标识4种双脱氧核苷酸，基本实现了测序自动化。遗传病的诊疗专业知识培训第39页

概念：基因芯片技术是DNA杂交探针与半导体工业技术相结合产物。将各种探针固定于支持物上后与带有荧光标识DNA样品分子进行杂交，经过检测每个探针分子杂交信号，进而获取被测样品中DNA分子数量和序列信息。该技术可用于大规模筛查由基因突变引发疾病。4.DNA芯片遗传病的诊疗专业知识培训第40页检测原理和步骤：

（1）制作芯片：依据疾病基因中突变位点区域核苷酸序列，合成20个核苷酸长探针，将其固定于芯片上，芯片上可固定成千上万个探针。（2）从被测对象细胞中提取DNA，用酶切成较小片段，对DNA作荧光标识，并熔解成单链。（3）将样品滴加到芯片上并与芯片上探针杂交，凡是与探针互补酶切片段会固定于特定位置上，不能互补片段会被洗脱掉。（4）对芯片上荧光作扫描和分析。GenescreeningusingaDNAmicroarray.遗传病的诊疗专业知识培训第41页非放射性原位杂交方法用特殊荧光素标识DNA探针，在染色体、细胞和组织切片标本上进行DNA杂交，检测细胞内DNA或RNA特定序列存在是否。

6．荧光原位杂交（FISH）

遗传病的诊疗专业知识培训第42页案例19-1

罗xx，女，34岁，曾生育过一个智力低下患儿，现再次妊娠，因惧怕再生同病患儿前来咨询。其患儿，男，6岁，智力低下，IQ值42。染色体核型分析为46，XY，-14，+t(14q;21q)。检验患儿父亲核型正常；而母亲是平衡易位携带者，核型为