药物的含量测定方法与验证

第四章

药物的含量测定方法与验证2024/7/192第四章

药物的含量测定方法与验证

定量分析方法的分类与特点

1样品分析的前处理方法2药品质量标准分析方法验证32024/7/193第四章熟悉分析法的原理2.不同前处理方法的适用范围3.不同方法对验证内容的要求掌握容量,光谱和色谱分析法2.滴定度与含量计算3.系统适用性试验内容与要求4.样品分析的前处理方法5.分析方法的验证内容学习要求滴定液的配制与标定2.分析仪器的校正和检定了解2024/7/194概述评价药物质量的重要指标

含量容量分析法光谱和色谱分析法

方法制剂:灵敏,专属

原料药:准确,重现剂型鉴别,检查和含量测定方法准确,稳定,耐用方法学验证2024/7/195第一节

定量分析方法的分类与特点

一、容量分析法二、光谱分析法三、色谱分析法2024/7/196一、容量分析法(一)特点与适用范围(1)方法简便易行(2)方法耐用性高(3)测定结果准确(4)方法专属性差

适用于原料药含量测定(二)有关计算:1.滴定度与滴定度计算2.含量计算

(1)直接滴定法

(2)间接滴定法生成物滴定法剩余量滴定法也称滴定法:将已知浓度滴定液滴加至被测药物溶液中,至滴定终点,根据滴定液的浓度,体积和滴定度,计算含量

容量分析法2024/7/197自动电位滴定仪2024/7/198(二)相关计算每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量,mg

1.滴定度m:滴定液的摩尔浓度（mol/L）a:被测药物的摩尔数b:滴定液的摩尔数M：被测药物的毫摩尔质量（分子量，mg）例1：碘量法测定维生素C2024/7/199每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6

Vc的M＝176.13，碘滴定液浓度0.05mol/L2024/7/1910例2：溴酸钾法测定异烟肼(C6H7N3O=137.14)的含量,溴酸钾滴定液浓度为0.01667mol/L(KBrO3为单元)

反应式:

每1ml溴酸钾滴定液(0.01667mol/L)相当于3.429mg的异烟肼(C6H7N3O)

滴定度:2024/7/19112.含量测定直接滴定法

生成物滴定法剩余量滴定法(1)(2)(3)2024/7/1912(1)直接滴定法注意掌握滴定反应的原理,药物与滴定剂在反应中的摩尔比正确计算滴定度和百分含量浓度校正因子2024/7/1913(2)生成物滴定法注意摩尔比的替换药物与A作用生成B,用滴定液滴定B百分含量计算方法与直接滴定法相同2024/7/1914(2)生成物滴定法滴定度

葡萄糖酸锑钠含量测定:本品约0.3g,加水100ml、盐酸15ml与碘化钾试液10ml,暗处放置10分钟,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定每1ml硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于6.088mg锑(Sb)反应式:2024/7/1915(3)剩余量滴定法(回滴法)加入定过量滴定液A,用滴定液B滴定剩余的A注意:滴定度为滴定液A的滴定度无空白进行空白校正2024/7/1916(3)剩余量滴定法

标准规定：司可巴比妥钠含量测定:本品约0.1g,加水10ml溶解,精密加溴滴定液(0.05mol/L)25ml,再加盐酸5ml,放置15分钟,加碘化钾试液10ml,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定,滴定的结果用空白试验校正。

实验数据：W=0.1022g;硫代硫酸钠滴定液F=1.038;供试品消耗硫代硫酸钠滴定液15.73ml;空白23.21ml2024/7/1917(3)剩余量滴定法滴定度司可巴比妥钠M=260.27,与溴摩尔比为1:12024/7/1918(3)剩余量滴定法滴定液A与滴定液B浓度是相当的溴滴定液(0.05mol/L)与硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当

因为溴(Br2)等摩尔转化为碘(I2),而碘(I2)与硫代硫酸钠(Na2S2O3)反应的摩尔比为1:2,所以溴滴定液与硫代硫酸钠滴定液的浓度比也是1:2滴定液A与滴定液B经浓度校正后的消耗体积(V’=V×F)是相当的2024/7/1919二、光谱分析法定义分类

UV-Vis利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法——光谱分析法

IR

AA

FluorFP(flamephotometry)2024/7/1920(一)特点与适用范围F-IR2024/7/1921(一)紫外-可见分光光度法1.特点与适用范围(1)方法简便易行(2)方法灵敏度高(3)结果准确度较高(4)方法专属性较差

制剂含量测定与定量检查2.仪器校正和检定

(1)波长

(2)吸光度的准确度

(3)杂散光

3.测定法

对照品比较,吸收系数计算光谱,比色法基于对紫外光区(200~400nm)和可见光区(400~760nm)单色光吸收特性的分析方法原理:

UV-Vis2024/7/1922(1)对照品比较法原料药制剂氟康唑片溶出度检查:取本品(规格:100mg),盐酸溶液(9→1000)1000ml为溶出介质,经45分钟时,取溶液滤过;取续滤液,在261nmm波长处测定吸光度;另取氟康唑对照品适量,精密称定,加溶出介质溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液,同法测定,计算每片的溶出量溶液浓度

2024/7/1923(2)吸收系数法原料药制剂溶液浓度

盐酸氯丙嗪注射液(规格：xxml:xxmg)的含量测定：精密量取适量(Vml,相当于盐酸氯丙嗪50mg),置200ml量瓶中,用盐酸溶液(9

1000)稀释至刻度,摇匀;精密量取2ml,置100ml量瓶中,用盐酸溶液稀释至刻度,摇匀,在254nm的波长处测定吸光度,按吸收系数()为915计算

2024/7/1924(二)荧光分析法1.特点(1)高灵敏度(2)荧光自熄灭(3)易受干扰

(4)线性范围窄

(RX–RXb)/(Rr–Rrb)=0.5~2

2.消除干扰

(1)溶剂:空白对照

(2)溶液:稀,净,充氮,pH

(3)器皿:洁净,无机清洁液3.测定法:对照品比较物质受UV或Vis照射激发后能发射出比激发光波长长的荧光;激发光停止照射,荧光随之消失;

激发和发射光谱用于定性,荧光强度用于定量Fluor2024/7/1925三、色谱分析法特点与应用分类

依据分离原理：(1)高灵敏度:ng-µg/ml(2)高专属性:选择性检测(3)高效能与高速度吸附;分配;离子交换;分子排阻色谱法

复方制剂含量测定的首选方法依据分离方式：纸色谱;薄层色谱;柱色谱;气相色谱;高效液相色谱法

2024/7/1926F-IR2024/7/1927(一)高效液相色谱法1.仪器(RP-HPLC)(1)色谱柱:ODS最常用;粒径一般在3-10

m;温度≯40℃(2)检测器:UV(DAD,PDA);Fluor,ELSD,RID,ECD,MS

(3)流动相:

首选甲醇-水(末端波长检测:乙腈-水),有机相≮5%;pH2-8

2.系统适用性试验

(1)色谱柱的理论板数(n)

(2)色谱峰的分离度(R)

(3)色谱系统的重复性(RSD%)

(4)色谱峰的拖尾因子(T)3.测定法

(1)内标法

(2)外标法不得改变：固定相种类,流动相组分,检测器类型可以改变：色谱柱内径,长度,载体粒度流动相流速,混合流动相各组分的比例柱温;进样量;检测器的灵敏度HPLC2024/7/19282.系统适用性试验分离度(R):用于评价组分的分离程度;关键指标重复性:用于评价连续进样系统响应的重复性能拖尾因子(T):用于评价色谱峰的对称性理论板数(n):用于评价色谱柱的分离效能n=(tR/

)2=16(tR/W)2;n=5.54(tR/Wh/2)2;RSD≥1.52024/7/19293.测定法与计算(2)外标法氨酚待因片(I)的含量测定取本品20片,精密称定,研细,精密称取适量,置250ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,滤过,取续滤液10µl进样;另精密称取磷酸可待因与对乙酰氨基酚对照品适量,加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含磷酸可待因0.03mg和对乙酰氨基酚2mg的溶液,同法测定(1)内标法2024/7/1930(二)气相色谱法检测器——FID进样方式

(1)溶液直接进样:

不超过数微升(

l);毛细管柱分流

(2)顶空进样:供试液于密闭小瓶中,加热至待测组分达到液-气平衡,进样器自动吸取一定体积的顶空气进样2.系统适用性试验

同HPLC3.测定法

(1),(2)同HPLC

(3)标准溶液加入法对照品溶液适量,精密加入到供试品溶液中,测定含量,扣除加入的对照品溶液含量即得色谱柱：常用毛细管柱——熔融石英或玻璃内径一般为0.25mm,0.32mm或0.53mm;柱长5~60m内壁或载体经交联或涂渍固定液;固定液膜厚0.1~5.0

m固定液:甲基聚硅氧烷,苯基甲基聚硅氧烷,聚乙二醇GC2024/7/1931第二节

样品分析的前处理方法一、不经有机破坏的前处理方法二、经有机破坏的前处理方法(一)水解法;(二)还原法(一)干法破坏;(二)湿法破坏2024/7/1932一、不经有机破坏的方法

1.酸水解法水难溶性含金属有机药物与矿酸(盐酸)共热:

十一烯酸锌测定

回流有机结合的待测元素原子离解,转化为无机盐(离子)2.碱水解法含卤素有机药物(脂肪碳链)与氢氧化钠溶液回流:三氯叔丁醇测定

适用于:结合不牢固的含金属或含卤素有机药物(一)水解法2024/7/1933一、不经有机破坏的方法碘他拉酸测定:氢氧化钠试液与锌粉回流后,用硝酸银滴定回流碱性溶液中加锌粉回流,使碳-碘键还原转化为无机碘化物碘番酸胆影酸胆影葡胺注射液泛影酸泛影酸钠泛影葡胺注射液

适用于:结合牢固的含碘有机药物

(直接与芳环连接)

(二)还原法2024/7/1934二、经有机破坏的方法(一)湿法破坏

适用于含氮有机药物分析的前处理

硫酸作为分解剂,氧化剂(硝酸,高氯酸)辅助分解剂

凯氏定氮法

(二)干法破坏高温炽灼法用于含卤素药物的鉴别无水碳酸钠,硝酸镁,氢氧化钙,氧化锌等辅助灰化

2.氧瓶燃烧法适用于:

含金属,卤素,氮,硫,磷等有机药物

(待测原子与碳原子结合牢固者)2024/7/19351.凯氏定氮法

(2)消解剂与助剂:硫酸-硫酸钾-硫酸铜

(3)操作法供试品:常量法含氮25~30mg;半微量法:1.0~2.0mg消解:溶液成澄明的绿色,继续加热30min蒸馏与接收:40%氢氧化钠碱化,水蒸气蒸馏,2%硼酸溶液吸收

滴定:甲基红-溴甲酚绿指示液,硫酸滴定液(0.05mol/L),灰紫色

(1)仪器装置(4)应用范围:含有氨基或酰氨(胺)结构

2024/7/19361.凯氏定氮法

扑米酮的含量测定取本品约0.2g,精密称定,照氮测定法测定;每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于10.91mg的扑米酮(C12H14N2O2)

关键步骤:消解试剂作用:硫酸-消解剂;硫酸钾-提高沸点;

硫酸铜-催化剂;硼酸-固氮(NH3·H3BO3)(5)示例与讨论C12H14N2O2=218.262024/7/19372.氧瓶燃烧法

仪器装置

铂丝:1mm;

2/3

瓶:硬质玻璃(石英玻璃) 10-20mg——500ml 200mg——1000-2000ml含待测元素的有机药物在充满氧气的燃烧瓶中充分燃烧 有机结构:彻底分解为CO2和H2O 待测元素:转化为不同价态的氧化物(或无氧酸) 被吸收于适当的吸收液中(多以酸根离子形式存在)

2024/7/19382.氧瓶燃烧法

(2)燃烧产物与吸收液

氟——HF: 水 氯——HCl: 水-氢氧化钠 溴——Br2+HBr: 水-氢氧化钠-二氧化硫 碘——I2(+HIO): 水-氢氧化钠(二氧化硫)

硫——SO3(+SO2): 水-过氧化氢

磷——P2O5→H4P2O7,(HPO3)n: 水-硝酸(煮沸)2024/7/19392.氧瓶燃烧法

(3)碘苯酯的含量测定20mg,氢氧化钠试液2ml与水10ml为吸收液吸收液,加溴-醋酸10ml,加甲酸1ml,并通空气3min加碘化钾2g,用硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)滴定摩尔比为1:6,T=416.34

(1/6)

0.02=1.388(mg)C19H29IO2=416.342024/7/1940需验证的项目验证的内容准确度定量限防腐剂溶出度,释放度鉴别试验杂质检查含量测定第三节

药品质量标准分析方法验证

精密度专属性检测限线性范围耐用性重复性中间精密度重现性2024/7/1941一、准确度(一)含量测定方法

(二)杂质定量测定加入已知量杂质进行测试

(三)数据要求9个测定结果

3个不同浓度

(80,100,120％) 每个浓度各3份准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度一般用回收率(%)表示定义2024/7/1942二、精密度1.重复性同一分析人员连续测定所得结果的精密度;也称批内精密度或日内精密度2.中间精密度

不同时间不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度批/日间精密度

3.重现性

在不同实验室不同人员测定结果之间的精密度

法定标准采用的分析方法进行

同一均匀供试品多次取样测定所得结果之间的接近程度标准偏差(s,SD);相对标准偏差(RSD)数据要求同“准确度”定义2024/7/1943三、专属性(一)鉴别反应空白,结构相似物或有关物质呈负反应(三)含量与杂质测定含杂质或降解产物的试样中各峰能获得分离在其他成分(杂质,降解产物,辅料等)可能存在下,方法能正确测定出被测物的特性鉴别,杂质检查和含量测定方法

定义与应用2024/7/1944四、检测限适用于可用目视法直接评价结果的分析方法,非仪器分析法鉴别的显色法;杂质检查的TLC适用于能直观显示信号与基线噪声水平的分析方法,如HPLC法

信噪比S/N=3(2)时的相应浓度或量适用于不能直观比较信噪比的仪器分析方法,如UV-Vis法

检测限(limitofdetection,LOD)是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量LOD是一种限度检验效能指标,反映方法灵敏度

1.目视法

2.信噪比法

3.标准偏差法

2024/7/1945五、定量限杂质和降解产物用定量方法研究时,应确定LOQLOQ的测定方法与LOD相同相应的系数(倍数)不同,如信噪比S/N=10定量限(limitofquantitation,LOQ

)是指试样中被测物能被定量测定的最低量;反映方法的灵敏度测定结果应具有一定准确度和精密度2024/7/1946六、线性与范围范围系指方法适用的高低限浓度或量的区间在试验研究开始前确定验证的范围和方法在范围内应能达到一定精密度,准确度和线性线性系指在设计的“范围”内,响应值(y)与被测物浓度(x)直接呈正比关系