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最新发育生物学实验目的基因的发育表达图式精品课件第一页，编辑于星期六：十四点五十五分。地高辛（DIG）标记的UTP

ALP标记的Anti-DIG抗体

ALP碱性磷酸酶显色

DIGAnti-DIG抗体ALPALP底物RNA原位杂交原理：主要是利用碱基互补原理，将体外合成的带有标记的单链反义RNA与组织或细胞中待测的mRNA发生杂交，从而将探针定位在特定基因的表达区域内。显色观察，确认其表达部位。标记物的种类分为2种，即非放射性的标记物（地高辛(DIG)和生物素(BIO)）或带有放射性的同位素(32P)。第二页，编辑于星期六：十四点五十五分。vasa基因——生殖细胞的标记分子栉孔扇贝胚胎和幼虫单环刺螠胚胎和幼虫三、实验材料第三页，编辑于星期六：十四点五十五分。第四页，编辑于星期六：十四点五十五分。四、胚胎原位杂交的实验流程RNA探针设计合成

思考：如何确保探针特异性？

反义RNA探针

正义RNA探针

HindⅢ线性化质粒1μgEcoRⅠ线性化质粒1μg10×转录缓冲液2μl10×转录缓冲液2μl10×NTP2μl10×NTP2μlRNase抑制剂1μlRNase抑制剂1μlT7RNA聚合酶2μlSP6RNA聚合酶2μlDEPC处理水至20μlDEPC处理水至20μl胚胎固定：4％多聚甲醛(PBS配制)，保存于100%甲醇中（-20℃）

体外转录带有T7/SP6噬菌体转录启动子的载体第五页，编辑于星期六：十四点五十五分。杂交流程（第一天）(12-16h)第六页，编辑于星期六：十四点五十五分。以上过程，为防止RNA酶污染，操作时需戴手套和口罩。试剂和容器处理：DEPC（焦碳酸二乙酯）或180℃复水、消化、后固定杂交、预杂交第七页，编辑于星期六：十四点五十五分。杂交流程（第二天）(显色：30min–2h)第八页，编辑于星期六：十四点五十五分。第九页，编辑于星期六：十四点五十五分。·胚胎预处理·预杂交和杂交·洗脱和抗体孵育·显色和观察实验主要阶段思考：各关键步骤的目的和原理，如何确定最佳条件第十页，编辑于星期六：十四点五十五分。第十一页，编辑于星期六：十四点五十五分。作业电子版上交vasamRNA在实验动物发育过程中的表达图式；根据实验结果，提出实

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