高效液相色谱法()文档

高效液相色谱法()第1节高效液相色谱仪2HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作；还会影响检测器的正常响应。一、输液系统（一）溶剂脱气与过滤①抽真空脱气②超声波振荡脱气③吹氦脱气溶剂应经过0.45μm滤膜过滤，以除去溶剂中的固体杂质，防止堵塞色谱柱、管路系统，保护高压泵3（二）高压输液泵对输液泵的基本要求：

①流量准确可调。流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度通常要求小于±0.5%。②耐高压。通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。③液流稳定。输出的液流应无脉动④泵的死体积小。泵的死体积通常要求小于0.5mL。⑤密封性能好，耐腐蚀4输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵，恒流泵的应用更广泛。5（三）梯度洗脱装置等度洗脱：用恒定配比的溶剂系统洗脱，方法简便、色谱柱易再生等是其优点。

梯度洗脱：在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的配比，逐步提高洗脱强度。梯度洗脱可以使一个复杂样品中性质差异较大的组分，都能在各自适宜的分离条件下分离。

梯度洗脱的特点：①缩短分析周期；②提高分离效果；③改善峰形，很少拖尾；④增加检测灵敏度。⑤基线漂移及重复性不佳6等度洗脱与梯度洗脱（弱）（强）A→B（弱→强）7高压梯度（外梯度）:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱低压梯度（内梯度）:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。8二、进样系统进样器要求密封性好，死体积小，重复性好。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，结构如图所示：9三、分离系统使用色谱柱注意事项：1溶剂和样品应过滤，防止堵塞。2加前置柱。3用完后要清洗色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，10四、检测系统要求检测器灵敏度高、噪声低、死体积小、线性范围宽、重复性好、适用范围广等。（一）紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。11紫外检测器包括固定波长、可变波长和光电二极管阵列检测器121024个二极管阵列10ms完成一次检测，1s采集100000个含吸光度、波长、时间的数据，得到一张吸光度、波长、保留时间的三维色谱图。13灵敏度高；线性范围宽；流通池可做得很小(1mm×10mm，容积8μL)；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。特点：（二）荧光检测器高灵敏度，高选择性。对多环芳烃，维生素B，黄曲霉素，卟啉类化合物，农药，药物，氨基酸，甾类化合物等有响应。1415（三）示差折光检测器通用型检测器，但灵敏度低，对温度敏感，不能用于梯度洗脱可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度成正比。16（四）蒸发光散射检测器这种检测器可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测，但对于有紫外吸收的组分的检测灵敏度较低，主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体等几十类化合物。在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散射光强度与样品微粒质量的关系为I=kmb式中，m为微粒质量，k、b为实验条件（如温度、流动相性质）决定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。1718五、数据记录处理和计算机控制系统数据处理系统又称色谱工作站：它可对分析全过程（分析条件、仪器状态、分析状态）进行在线显示，自动采集、处理和储存分析数据。19第2节基本理论高效液相色谱法的塔板理论与气相色谱法完全相同，速率理论略有差异。一、柱内展宽1.涡流扩散项涡流扩散项与气相色谱法相同，A＝2λdp

高效液相色谱多使用3～10um球形固定相颗粒,以均浆高压装填，A较小。202.分子扩散项3.流动相传质阻力项流动相传质阻力，实际包括两方面，一是移动流动相传质阻力Hm，二是滞流（静态）流动相传质阻力Hsm。组分在液体中的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液相色谱中,B/u很小，可忽略不计。2122a.移动流动相传质阻力（Cmu）当流动相在色谱柱内流动时，离固定相较远的组分流动较快，处于固定相颗粒表面的组分流动较慢，由于这种差别，会使组分的色谱峰扩展.展宽大小与固定相颗粒直径平方成正比，与流动相线速度成正比，与组分在流动相中的扩散系数Dm成反比：b.滞流流动相传质阻力（Csmu）2324流动相在色谱柱中流动时，有部分流动相进入到多孔的固定相深孔中，滞留后难以流动。组分分子进入滞留区造成色谱峰扩展，使柱效降低，4.固定相传质阻力项（Csu）组分分子在固定液中传质时，因所受到的阻力不同而引起色谱峰扩展在键合相色谱法中，df很小（单分子层），固定相传质阻力可以忽略。25在高效液相色谱中，范第姆特方程可写成：H＝A+Cu＝A+Cmu+Csmu随着u的增大，H增大，柱效降低，故其最佳流速就在u很小的地方。26为了减小柱内展宽，提高柱效，可采取以下措施：(1)用小而均匀的球形固定相，填充均匀，以减少涡流扩散。（2）使用低粘度的小分子溶剂作流动相，减小流动相传质阻力；(3)流动相的流速低，一般控制在1mL/min左右二、柱外展宽（4）柱温25℃左右为宜。柱温太高，虽Dm增大，传质阻力减小，但易产生气泡，太低不仅减小Dm，使传质阻力增大，而且流动相的粘度增大，柱阻加大。27采用小体积检测器，管道对接宜呈流线形，减少柱外死体积，从而减小柱外展宽，提高柱效。从进样器到检测器之间，除色谱柱以外，其它因素导致的谱峰展宽。28HPLC高效液相LSC液固LLC液液IEC离子交换SEC空间排阻AC亲和色谱IC离子色谱BPC化学键合相NPBPC正相—RPBPC反相—PIC离子对ISC离子抑制第3节各类高效液相色谱法29一、吸附色谱法固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂.有时也用高分子多孔小球（吸附+分配并兼有小孔凝胶作用）以固体吸附剂为固定相，基于其对不同组分吸附能力的差异进行混合物的分离。流动相：常用混合溶剂，主体溶剂为正己烷或环己烷，以一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷或丙酮等作为调节剂，用于调整流动相的极性。30a.表面多孔型b.无定形全多孔c.球形全多孔d.堆积全多孔应用：主要用于分离能溶于有机溶剂的极性与弱极性混合物及异构体的分离。二、化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法。强极性组分后出峰，弱极性组分先出峰31（一）化学键合固定相用化学反应的方法将有机分子键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合固定相，简称键合相。化学键合相已广泛用于正相与反相色谱法、离子对色谱法等诸多色谱法中。1、键合反应化学键合相的载体是硅胶，表面有≡Si—OH，能与合适的有机化合物反应，使具有不同极性功能团的有机分子键合在表面而获得不同性能的化学键合相，它的制备方法主要是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应（硅烷化），生成Si-O-Si-C键合相。

32由于空间位阻效应，不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上，使得部分硅醇基未反应。残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，它可以减小键合相表面的疏水性，对极性溶质产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化，降低了键合相填料的稳定性，使组分的峰形拖尾。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用小分子三甲基氯硅烷等进行钝化处理，称封尾。33342.键合相的分类（1）非极性键合相这类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基与苯基等。十八烷基键合相（ODS）是最常用的非极性键合相。351-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯固定相：C1固定相：C8固定相：C18非极性键合相常用于反相色谱。键合烷基的链长增加，极性降低，载样量增大、k值增大，C18分离效果优于C8,C136（2）中等极性键合相中等极性键合相常见的有醚基键合相（如YWG-ROR′）。这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。（3）极性键合相常用氨基、氰基键合相。分别将氨丙硅烷基[—Si(CH2)3NH2]及氰乙硅烷基[—Si(CH2)2CN]键合在硅胶上而制成。它们可用作正相色谱的固定相。（4）离子交换键合相离子交换基团如-SO3－，-NR3＋键合在担体表面。373.键合相的性质（1）稳定性键合相在pH2-8.5范围内稳定，太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。（2）键合量键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，按含碳量的不同，可分为高碳、中碳及低碳型键合相。38高碳ODS键合相：若R1、R2是二个甲基，构成高碳ODS键合相［Si-O-Si(CH3)2-C18H37］。中碳ODS键合相：若R1是氢，R2是氯，氯与硅胶的另一个硅醇基脱HCl，则生成中碳ODS键合相［（Si-O-)2Si(H)-C18H37］；低碳ODS键合相：若R1、R2都是氯，与硅胶的另二个硅醇基再脱二分子HCl，生成低碳ODS键合相［(Si-O-)3Si-C18H37］。39（3）表面覆盖度覆盖度的大小决定键合相是分配还是吸附占主导。Partisil5-ODS的表面覆盖度为98％，即残存2％的硅醇基，分配占主导。Partisil10-ODS的表面覆盖度为50％，既有分配又有残余硅醇基的吸附作用。含碳量大，则载样量大，保留能力强40（二）正相键合相色谱法最常用的有氰基（-CN）氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）极性键合相。流动相一般用非极性或弱极性有机溶剂，如正己烷溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离能溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。4.键合相的特点①固定相不易流失，寿命长②选择性好③稳定性好④传质快，柱效高⑤适于作梯度洗脱。41分离选择性：极性强的组分k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR减小。分离机制分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用42（二）反相键合相色谱法

典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。反相色谱的保留机制还没有一致的看法，有分配与吸附之争，还有疏溶剂理论等。键合基团的覆盖率高，分配为主；覆盖率低，吸附为主。如果覆盖率高，对残余硅醇基封尾，则吸附作用大为降低。43疏溶剂理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从极性流动相中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动的亲合作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。44保留行为的主要影响因素1、溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。同系物碳数越多，极性越弱，k越大；2、固定相硅胶表面键合烷基越大，覆盖度越大，则溶质的k越大。3、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大溶剂种类：水为弱溶剂，醇、已腈为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使k增大45稠环芳烃的分析固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min流速：1mL/min柱温：30ºC柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器46反相键合相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物.派生的离子抑制法、离子对法还可用于酸、碱、盐的分析。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。（三）反相离子对色谱法

把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（counterion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。47原理

样品离子反离子

中性缔合物（只溶于有机相）

有机碱

A固定相

+

↕离子对试剂水相48影响容量因子的因素离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大固定相、流动相性质（同一般RP-HPLC）。

离子对试剂的选择分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）等49分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸钠（PICB6）、适用范围：有机酸、碱、盐等离子型和非离子型化合物的混合物。反相离子对色谱很易实现，用ODS柱，在流动相甲醇-水或乙腈-水中加入0.03～0.01mol/L的离子对试剂即可。反相离子对色谱法分析奶粉中三聚氰胺流动相：含10mM柠檬酸和10mM辛烷磺酸钠的缓冲液(pH3.0):甲醇=7:350（四）离子抑制色谱法用反相色谱法，通过调节流动相的pH值，抑制组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。1．抑制剂通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐及醋酸盐）为抑制剂，调节pH值，抑制组分的解离，增加中性分子存在的几率。如分离十二烷酸时，可在流动相乙腈/水中加入少量乙酸，以抑制十二烷酸的离解512．容量因子及其影响因素除与反相色谱法有相同的影响因素外，主要受流动相的pH值的影响。对于弱酸，即流动相的pH值小于它的pka值时，主要以分子形式HB存在，k值增大，tR增大；反之，pH＞pka，组分以离子形式B为主，k值变小，tR减小，对于弱碱，情况相反。523．适用范围适用于3.0≤pKa≤7.0的弱酸；6.0≤pKb≤7.0的弱碱。对于pKa＜3.0的酸及pKb<6.0的碱，应采用离子对色谱法或离子交换色谱法。在进行离子抑制色谱法时，流动相的pH需在2～8之间流动相的pH值应调节至比组分的pK值大（对碱）或小（对酸）1~2个单位以上，使分子形式的的分布系数较大，有较大的k值。53（四）分离类型的选择54第4节改善分离度的方法在高效液相色谱分析中，实际上固定相种类的选择十分有限，当色谱柱选定后，主要通过调节流动相的组成改善分离.虽然n也受流动相的影响，但主要由色谱柱的性能所决定，溶剂系统主要影响容量因子k和分配系数比α。选择不同种类的溶剂或改变多元溶剂系统的配比，都会改变k和α值，影响分离度。55一、对流动相的要求①与固定相不互溶②纯度高不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”③粘度低若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有水、丙酮、甲醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.

56④与检测器匹配⑤对样品有适宜的溶解度⑥毒性小1.加入调节剂调节k二、改善分离度的方法使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物有较大差异。57通常希望组分的容量因子k保持在2~10范围内，若组分的k值大于10或小于2时，可通过调节流动相的极性，来获取适用的k值。在正相色谱中常采用饱和烷烃如正己烷作主体溶剂，加入具有不同选择性的溶剂如乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷等，来调节溶剂的洗脱强度。极性增加，溶剂的洗脱能力增强，保留时间缩短。若组分的保留时间短，表明溶剂的极性太大,改用极性小的溶剂。若组分的保留时间太长，可改用极性较大的溶剂。58在反相色谱中则常采用水为主体溶剂，加入甲醇、乙腈、四氢呋喃等来调节溶剂的洗脱强度，溶剂溶剂极性参数P'k减少倍数*