考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座

1.限制酶选择标准考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第1页（1）依据目标基因两端限制酶切点确定限制酶种类①应选择切点位于目标基因两端限制酶，方便将目标基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目标基因内部限制酶，以防破坏目标基因，如图甲不能选择SmaⅠ。③为防止目标基因和质粒本身环化和随意连接，也可使用不一样限制酶切割目标基因和质粒，如图甲也可选择用Pst

Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶切点），而且这种切点不致于破坏全部“标识基因”以及开启子和终止子。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第2页（2）依据质粒特点确定限制酶种类考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第3页①所选限制酶要与切割目标基因限制酶相一致，以确保含有相同黏性末端。②质粒作为载体必须具备标识基因等，所以所选择限制酶尽可能不要破坏这些结构，应最少含有一个完好标识基因，如图乙中限制酶pst

Ⅰ因其会破坏标识基因而不宜选择。③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，假如所选酶切点不止一个，则切割重组后可能会丢失一些片段，若丢失片段含复制原点区，则切割重组后片段进入受体细胞后不能自主复制。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第4页④所选限制酶，其切点应位于开启子与终止子之间，如图乙中HindⅢ会破坏开启子，EcoRⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出切口可让目标基因嵌入开启子与终止子之间。（3）参考Ti质粒T－DNA片段选择限制酶若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目标基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒T－DNA片段最易转移至受体细胞而且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba

Ⅰ和Sac

Ⅰ（两种酶切出黏性末端不一样）切割某DNA，取得含目标基因片段。若利用该片段构建基因表示载体，则下列图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析以下）考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第5页考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第6页2.目标基因检测与判定

（1）界定“标识基因”与“DNA分子杂交技术”在目标基因检测中作用： ①载体上标识基因标识原理

载体上标识基因普通是一些抗生素抗性基因。目标基因要转入受体细胞没有抵抗相关抗生素能力。当含有抗生素抗性基因载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表示，使受体细胞能够抵抗对应抗生素，所以在受体细胞培养体系中加入该种抗生素就能够只保留转入载体受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目标基因”转入，能存活时必含该载体，原理以下列图所表示：考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第7页②“标识基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目标基因是否转入？经上述步骤筛选得到受体细胞，只是含特定标识基因质粒，然而，该质粒上是否成功嵌入了目标基因，还不能确定，故仍需使用“目标基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞质粒上是否含目标基因。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第8页（2）使用“目标基因”作探针，利用“分子杂交技术”检测目标基因是否转录出特定mRNA。（3）采取“抗原—抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质（作抗原）与对应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目标基因是否“指导”特定蛋白质合成。（4）采取抗虫、抗病毒等“接种试验”进行目标基因成功表示“个体生物学”水平检测。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第9页【例证】

（·全国卷Ⅲ，40）图（a）中三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶识别序列与切割位点，图（b）为某种表示载体示意图（载体上EcoRⅠ、Sau3AⅠ切点是唯一）。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第10页依据基因工程相关知识，回答以下问题：（1）经BamHⅠ酶切后得到目标基因能够与上述表示载体被

酶切后产物连接，理由是________________________________________________________。（2）若某人利用图（b）所表示表示载体取得了甲、乙、丙三种含有目标基因重组DNA分子，如图（c）所表示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表示目标基因产物有

，不能表示原因是_______________________________。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第11页图（c）（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来酶，常见有

和

，其中既能连接黏性末端又能连接平末端是_________________________________。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第12页[慧眼识图获取信息]（1）三种限制酶切割结果分析考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第13页（2）表示载体与重组DNA分子分析考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第14页答案（1）Sau3AⅠ两种酶切割后产生片段含有相同黏性末端（2）甲、丙甲中目标基因插入在开启子上游，丙中目标基因插入在终止子下游，二者目标基因均不能被转录（3）E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第15页1.（·湖南长沙长郡中学月考）下列图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素试验流程。所用pBR322质粒含有限制酶Pst

Ⅰ、EcoRⅠ和HindⅢ切点各一个，且三种酶切割形成末端各不相同，而Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第16页（1）过程①所用到组织细胞是

，过程④所用酶是

。⑤过程惯用

溶液处理大肠杆菌。（2）经②过程得到互补DNA片段，称为

。（3）假如用限制酶Pst

Ⅰ、EcoRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，用一个酶、两种酶和三种酶分别切割时形成DNA片段种类与用一个酶和两种酶分别切割时形成DNA片段种类

（填“相同”或“不一样”），这些种类DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因DNA片段和四环素抗性基因DNA片段分别有

种和

种。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第17页（4）假如只用限制酶Pst

Ⅰ切割目标基因和质粒，完成过程④、⑤后（受体大肠杆菌不含Ampr、Tetr），将三角瓶内大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取培养基甲上单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基相同位置上，一段时间后，菌落生长情况如图乙、丙所表示。接种到甲培养基上目标是筛选

大肠杆菌；接种到培养基乙上大肠杆菌菌落，能存活大肠杆菌体内导入是

。含有目标基因大肠杆菌在培养基乙和丙上生存情况是_______________________________________________。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第18页（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上过程，属于基因工程基本操作中_______________________________________________________________步骤。该基因工程中pBR322质粒彻底水解产物是______________________。解析（1）过程①取得是人生长激素mRNA，所以组织细胞取自人垂体组织细胞；过程④构建基因表示载体酶是DNA连接酶；过程⑤将基因表示载体导入大肠杆菌前，惯用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。（2）②过程是人生长素mRNA逆转录形成cDNA过程。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第19页（3）Pst

Ⅰ、EcoRⅠ和HindⅢ三种酶切点分别用1、2、3表示，一个酶酶切时，一共能够得到3种相同长度片段；两种酶酶切时，可得到1－2，2－1，2－3，3－2，1－3，3－1六种片段；三种酶酶切时，可得到1－2，2－3，3－1三种片段，与前面重复，所以用一个酶、两种酶和三种酶分别切割时形成DNA片段种类与用一个酶和两种酶分别切割时形成DNA片段种类相同。这些种类DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因DNA片段和四环素抗性基因DNA片段分别有3种和3种。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第20页（4）在甲中能生长是含有四环素抗性细菌，含有四环素抗性基因；在乙培养基中能生长是含有四环素和氨苄青霉素抗性细菌，所以导入是完整pBR322质粒或含有Ampr、Tetr质粒。与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙培养基中这两个菌落中大肠杆菌成功导入了重组质粒，而且目标基因插入质粒后，破坏了氨苄青霉素抗性基因，使含有目标基因大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素乙培养基上生长，但四环素抗性基因是完好，则含有目标基因大肠杆菌能在含有四环素丙培养基上生长。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第21页（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上过程，属于基因工程中筛选含目标基因受体细胞步骤。该基因工程中pBR322质粒化学本质是DNA，其彻底水解产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。答案（1）人垂体组织细胞DNA连接酶CaCl2（2）cDNA（3）相同3

3（4）含四环素抗性基因完整pBR322质粒（或含有Ampr、Tetr质粒）在丙中能存活，在乙中不能存活（5）筛选含目标基因受体细胞磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第22页2.（·河南名校联盟调研）如图所表示为培育转基因细菌操作流程，回答以下问题：（1）图中①过程所用工具酶有

。为了预防载体和外源DNA自连，应怎样操作？______________________________________________。（2）当细菌转化过程中吸收外源DNA是病毒DNA时，该转化过程又称转染。图中外源DNA来自

。为了提升转染效率，应使用

处理细菌。（3）图中②过程，重组DNA增殖时需要哪些条件？_________________。考点加强课限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定专家讲座第23页（4）图中③过程，筛选含重组质粒细菌需用到

基因功效。已知所用载体内有青霉素抗性基因和四环素抗性基因两种抗性基因，请写出能在含四环素培养基上生长，但不能在含青霉素培养基上生长细菌即为含外源DNA细菌前提条件：_____________________________________________________________________________________________________________________（答出两点即可）。解析依据转染定义可知，