细胞培养技术基础教材

细胞培养技术基础第一个问题…我根本不知道细胞是什么我听说过细胞培养，但没有见过我见过别人操作，但是没亲自养过我会养至少1种细胞我各种培养精通，今天纯属来打酱油细胞培养基本概念（一）原代培养：细胞是直接通过机械分离，酶解等方式从动物组织，胚胎或成体中获得的组织块培养获得。形态上与来源的组织的细胞相似；生理上也接近体内的细胞；有限传代细胞:正常的细胞只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖的能力。这种细胞就被称为有限传代细胞系；形态与生理特性仍与来源处细胞比较接近；增殖快的细胞会占据优势，最终导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度一致；有限传代细胞系可以转化成持续传代细胞系（如：引入病毒的SV40）连续传代细胞株/系：通过对高生长率的细胞筛选，自然或人工转化的方式可以得到性状稳定，能无限传代的细胞；相当部分来源于肿瘤细胞，也可以通过人工转化；形态学，细胞功能，生长特性发生改变；由于基因型的改变，有时不能很好地模拟invivo的情况；实验中使用相对原代或有限传代细胞更容易获得及培养；细胞培养基本概念贴壁细胞：这类细胞在培养皿表面黏附，形成单层细胞大多数组织来源的细胞都需要贴壁才能生长，包括成纤维细胞核上皮细胞。容易进行显微观察、杂交和其他试验悬浮细胞：在培养基中悬浮生长。起源于血液，脾脏或骨髓的细胞，特别是未成熟的细胞趋向悬浮生长。悬浮培养的好处是容易得到大量悬浮细胞，收集容易。细胞培养的应用细胞培养主要优势：使用一批同源细胞获得稳定、可重复的结果。细胞培养可以为细胞正常生理和生化、药物和毒性化合物对细胞的作用以及致突变和致癌研究提供上佳的模型系统。细胞培养还可以用于药物筛选和开发以及生物化合物的大规模生产。……细胞培养操作安全预防实验室感染工作台和相关实验仪器设备均要保持干净整齐和定期消毒，以防止被试剂或细胞培养物污染。新洁尔灭或84消毒：细胞房的地面和实验室台面设备等等酒精：70%医用酒精常规消毒废弃物处理：每日清理垃圾和废弃物细胞培养废弃物（枪头，培养皿，废液等等）要按规定进行单独处理生物安全性等级美国疾控预防控制中心（CDC）和国立卫生研究院（NIH）制定、美国卫生和福利部颁布的《微生物和生物医学实验室生物安全》文件，规定了四个逐渐升高的安全等级：BSL-1~4级。中国也先后出台多项法律法规以保证生物实验室安全。生物安全性等级与操作要求*所操作的微生物危险等级参考《人间传染的病原微生物名录》（卫生部，2006），并向实验室管理人员咨询相应的操作区域与设备细胞培养设备细胞培养的基本设备：细胞培养通风橱（层流通风橱或生物安全柜）CO2培养箱（5%CO2，37度恒温）恒温水浴锅移液器离心机冰箱和冰柜：用于储存培养试剂倒置显微镜：观察和记录耗材：细胞培养基：根据所培养的细胞选择配制培养容器：培养皿，培养瓶，多孔细胞培养板，滚板等等无菌的一次性吸管、移液头、离心管等等70%医用酒精、酒精棉球其他：废液罐、pH计等等无菌操作基础实验往往要求一段时间的连续培养，因此，保护细胞免受细菌、真菌和病毒等微生物的污染对成功的细胞培养至关重要。无菌技术主要包括以下几个方面：清洁的细胞房工作环境使用无菌或灭菌的玻璃及塑料器皿良好的个人卫生习惯和操作技巧保持培养基、试剂不受污染清洁的细胞培养工作区细胞培养通风橱/生物安全柜：相对封闭的操作环境工作区能保持清洁，容易维护需要定期更换HEPA滤网需要供电操作前后用紫外灯照射操作前后用70%酒精擦拭当使用结束后关好玻璃柜门独立的层流细胞培养间：实验室中划出的独立区域所有气体经过HEPA滤网过滤清洁的塑料或玻璃器皿细胞培养用移液管、试剂瓶、培养皿、多孔板等等

一次性的塑料制品：经处理的表面，细胞更容易贴附生长，特别是单层细胞培养比可重复使用的玻璃制品贵适合4度冰箱低温保存玻璃制品：能耐受0度以下低温可以反复灭菌使用良好的个人卫生习惯和操作技巧穿好实验服、戴好乳胶手套，换专用拖鞋。用70%酒精擦拭工作区只有在操作时才打开灭菌的培养皿，培养板的包装，实验结束后未使用的器材要尽快包好实验所用的移液管，移液器枪头只有在工作台内打开包装并且保持干净细胞培养用的培养基或试剂均需要预先过滤或高温灭菌保持试剂瓶与桌面成45度角的时候打开瓶盖，打开后不要将瓶盖开口朝上放置。使用完要立刻盖上盖子每瓶溶液用单独的移液管，避免移液管或枪头碰触任何的非灭菌物品，移液管不要留在瓶内工作区内尽量减少手臂运动，提前准备好可能用到的东西。酒精灯附近会形成向上的气流，操作可以在酒精灯附近完成。细胞培养基完全培养基的成分细胞生长所需必需氨基酸、维生素、有机盐、葡萄糖

和一定比例的血清（血清中含有生长因子，激素及细胞因子），酚红及抗生素血清和基础培养基（MEM、DMEM、RMPI1640等等）分开购买细胞培养时常添加10%小牛血清，胎牛血清，也有部分细胞需要马血清，羊血清。pH值培养基的pH值介于7.2-7.4一般都会以NaHCO3缓冲当培养基中的营养消耗时，培养基中的酚红（指示剂）会变黄。细菌污染或者培养箱中CO2浓度过高也会引起变黄，注意区分不同的培养基配制时需要添加不同浓度的NaHCO3细胞培养基（续）市售基础培养基干粉：需要自行加去离子水按比例配制，价格最低；需要用0.22微米滤器正压过滤。（负压产生的泡沫会破坏其中的蛋白成分）浓缩液：用灭菌去离子水按比例稀释液体：直接可以使用，方便，进口的液体培养基价格最昂贵。血清：血清是非常昂贵的试剂，常常分装后冻存，在使用前再加入培养基中不同细胞需要的血清种类和浓度不同，请事先确认通过血清可能传播某些感染因子或颗粒，因此只购买能够确定血清来源的血清。例如，禁止从出现疯牛病的国家进口牛血清市面上有假冒血清，不要为省钱去购买来源不明的血清同一品牌不同批次的血清仍可能存在差异，尽量购买使用后效果好的批次培养基储存存放4度冰箱暗处避光保存，某些成分对光和热敏感禁止高温灭菌血清可以在使用时再按比例添加细胞的获得请同一实验室的同事同学给送给你观看赠送者的培养操作步骤，尽量记下操作细节特殊细胞系需要请某些实验室赠送找出使用该种细胞的文献和报告，写信请求向周围的人询问原代细胞一般需要自行取得，很少有人赠送向可靠的细胞库购买常用细胞库除列表外仍然有其他的一些可靠来源，请向同实验室的人咨询细胞的获得当你拿到一株细胞时，需要了解：有没有使用抗生素，使用的抗生素浓度是多少？细胞是怎样生长的？贴壁还是悬浮？生长速度快慢？传代的方法是什么？最适合的传代密度是多少？密度过高是否会发生分化？最好使用的是什么培养基？血清类型和比例是多少？是否需要其他成分？培养皿是否需要做特殊处理？胶原包被？Laminin?对一个细胞系的特性了解的越多，越容易解释和解决培养中可能出现的问题。例：细胞株的说明书来源：例：细胞株说明书-ATCC来源：/例：细胞株说明书（续1）例：细胞株说明书（续2）细胞的日常维护为了维护细胞，必须：给养：细胞生长过程中汇消耗培养基中的某些必需因子，必须及时更换培养基传代：随着细胞的生长，细胞数量会不断增长，多数细胞每24小时增殖一倍，很快培养皿里就满了冻存：无论什么时候你获得或构建了一个细胞株，都必须分装冻存。避免细胞受到污染后发生表型漂变永远不要在没有进行显微镜观察的情况下就进行细胞传代、实验或者冻存细胞。贴壁细胞的传代从细胞培养瓶中小心吸走培养基缓慢加入37度温浴的PBS或不含血清的培养基，让培养基沿容器壁流下，小心不要直接滴在细胞上，以免冲掉附着不牢的细胞小心移去PBS或培养基加入含0.25%胰蛋白酶的PBS，加入量以刚没过细胞为宜停留30秒左右，立刻吸去胰蛋白酶室温放置5-15min，每隔几分钟用肉眼观察当容器晃动时细胞是否脱落，如果是，下一步。如果没有，可以在37度保温5min加入含血清的新鲜培养基，吹打细胞使细胞分散，在显微镜下确认获得的是游离的单个细胞吸取少量细胞悬液到EP管细胞计数，确定需要的稀释倍数吸出适量的悬液到新的培养皿或培养瓶中，加入适量的新鲜培养液轻轻晃动培养瓶，使细胞均匀分散在培养皿表面将细胞放回培养箱，适度拧松盖子悬浮细胞的传代从培养箱中取出培养瓶，轻轻摇匀培养瓶中的细胞培养物，吸出大约1ml到EP管中对细胞进行计数，同时观察细胞状态计算所需要的稀释倍数，决定需要的种子液的量吸出适量的细胞到新的培养瓶加入适量37度预热的新鲜培养基将培养瓶放回培养箱中，并把盖子松开，以便进行充分的气体交换继续培养原瓶细胞，不加入新的培养基，以防传代后细胞污染，在培养瓶上标明“备份”，并在下一次传代后丢弃活细胞计数

将台盼蓝染液与细胞样品混合。活细胞会排斥染料进入，而死细胞会染成深蓝色。推荐稀释比为1:20（5µl细胞悬液加入95µl台盼蓝染液)将混合液小心地填满血细胞计数器的小室静置1-2min在显微镜下数出4个1x1x0.1mm面积内的细胞数，死细胞和活细胞最好都数出来理想的情况下，每个小室大约有200-500个细胞

细胞悬液的浓度：每个1x1x0.1mm面积内的细胞数量=细胞数x1*10^-4cm3，即为(1*10-4ml).再乘上稀释倍数避免同一个细胞数两次，只数两条边细胞冻存细胞可以在-135~175度的液氮中保存保存上几年时间，或者在-80度冰箱中保存几个月而仍能复苏生长冻存细胞以防备因为意外而损失重要细胞系即使是无限传代的细胞系，经过长期传代和培养都可能发生表型漂变准备细胞冻存所需的试剂和设备耗材：参考ATCC、细胞库提供的冷冻特定细胞株的冷冻配方一般冻存液为10%DMSO+90%FCS专用的细胞冻存管，一般都带有螺纹盖，可以耐受低温。不能使用EP管在液氮罐里找好存放细胞的位置选择生长状态良好的对数生长期细胞进行活细胞计数，不要冻存死细胞比例达到20%的细胞根据冻存细胞量准备冻存管，每个管一般装1ml液体，细胞量在5X106左右准备好冻存液，一般冻存液包含10%DMSO+90%FCS，也可以是10%DMSO+20%FBS+基础培养基用冻存液重悬细胞，轻柔的吹散细胞每个冻存管装入1ml悬液，并放在冰上30min将冻存管放入-80度冰箱24小时过夜转移到液氮罐或超低温冰箱长期保持细胞冻存流程细胞复苏流程将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37度水浴锅中快速解冻（1min内）捏住冻存管的盖子部分，轻轻而快速的转动冻存管，小心不要让水没过盖子或渗入冻存管内全部解冻后，在生物安全柜中将内容物转移到15ml离心管中添加10ml预热的完全培养基，在200X的离心力下将细胞悬液离心5-10分钟。实际的离心速度和时间取决于细胞的种类小心的移去培养基，用预热的培养基重悬细胞。以适当的密度转移到培养瓶或者培养皿中，放回细胞培养箱大约1hr后可以观察细胞的生长情况发生细胞污染是件让人抓狂的事！！！让人抓狂浪费时间和金钱丢失有价值的细胞和产物获得错误的数据识别污染肉眼观察：将培养皿瓶拿起来，对着光线检查浑浊：即使细胞的密度很高，培养基也应该是透明的。细菌、酵母都会导致培养基浑浊。霉菌可能在培养基的表面形成菌落培养基的颜色：酸性条件下，加了酚红的培养基会变黄；碱性条件下则会偏紫。细菌污染会使培养基变黄，真菌污染则会使培养基变成深紫红色。闻！当然不能直接打开瓶子去闻。许多污染发生以后都会散发出易察觉的、特殊的气味，甚至一开培养箱门就闻到了显微观察：其他微生物：真菌的菌丝、酵母、细菌，根据形态可以初步判断损伤和死亡的细胞：感染会杀死细胞，可能导致每个细胞裂解，或细胞层从附着物上完全剥离，更可能是细胞变得不规则，在低倍镜下看到黑色的粒状物细菌污染非常常见容易与细胞碎片弄混注意细菌有游动能力，而且形态一致注意pH值下降培养基浑浊真菌与酵母污染也很常见个体较大，容易发现和区分酵母明亮，有些有出芽真菌往往在培养基表面形成聚落污染的处理首先鉴别发生污染的是细菌、真菌、酵母或是支原体将被污染的培养物与其他的细胞分开。清洁细胞培养箱和生物安全柜，检查HEPA滤网是否需要更换如果细胞系不是特别难获得的那种，丢掉被污染的细胞，复苏新的细胞。特殊情况下，用2-3倍的浓度的抗生素培养2-3代。再用无抗培养基培养1代重复以上两步用无抗的培养基培养4-6代以确定污染是否已经完全去除常用抗生素抗生素并不能抑制所有的污染滥用抗生素也是引起支原体污染的原因除非特别必要，不推荐使用两性霉素B支原体污染支原体是一类普遍而难察觉的污染支原体仅有0.3微米，显微镜下通常观察不到支原体没有细胞壁，对常用的抗生素不敏感支原体污染会造成不易察觉的细胞