叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定

叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定一、实验目的和要求：掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。二、实验内容和原理：以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下：1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。C32H30ON4MgCOOCH3COOC20H39+2KOHC32H30ON4MgCOO—COO—+2KOH+CH3OH+C20H39OH2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。？？3、取代反应。

在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。

H+取代Mg2+,Cu2+(Zn2+)取代H+

。CCCCNCCCCNCCCCNCCCCNHHCCHHCCCH2CHCH3R1—H3CH3C——CH3CCCCNCCCCNCCCCNCCCCNCuCCHHCCCH2CHCH3R1—H3CH3C——CH3褐色绿色4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。透射光下呈绿色反射光下呈红色5、光谱分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。

abRelativeabsorbtanceWaverlength(nm)三、主要仪器设备：1、天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机2、研具、各种容（量）器、酒精灯等四、操作方法与实验步骤：1．定性分析：鲜叶3-5g+95%乙醇15ml（逐步加入）,磨成匀浆

过滤入三角瓶中观察荧光现象透射光

色，反射光色。皂化反应(约1ml)

加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和H2O1ml分层后观察:上层呈

色，为

，吸收

光。下层呈

色,为

,吸收

光。取代反应（约1mL）加醋酸约1ml，变褐（

叶绿素）,取1/2加醋酸铜粉加热变

色，为

叶绿素。定性实验无需移液管量2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：皂化反应的上层黄色石油醚溶液留1/3反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰（稀释470nmOD0.5-1）（稀释离心，663nmOD0.5-1）3．叶绿素定量分析：鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取2份0.2ml加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb和Chl总量的值。五、实验数据记录和处理Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69

OD645Cb

(mg/L)=22.9OD645-4.68OD663CT(mg/L)=Ca+Cb或OD652

1000/34.5Chla含量(mg/g.FW)=（Ca(mg/L)/1000）

2/0.15/0.2Chlb含量(mg/g.FW)=（Cb(mg/L)/1000）

2/0.15/0.2Chl总含量(mg/g.FW)=（CT(mg/L)/1000）

2/0.15/0.2六、实验结果与分