(高清版)GBT 42080.2-2022 分子体外诊断检验 冷冻组织检验前过程的规范 第2部分：分离蛋白质

冷冻组织检验前过程的规范processesforfrozentissue—Part2:Isolatedproteins(ISO20184-2:2018,国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会GB/T42080.2—2022/ISO20184-2:2018 I Ⅱ 1 1 4 4 5 66.2标本病理学评估和样品选择 6 76.4贮存要求 8 86.6分离蛋白质的定性和定量评估 9附录A(资料性)蛋白质定量检测显示冷缺血过程中蛋白质含量的变化 A.1概述 A.2示例 参考文献 I本文件是GB/T42080《分子体外诊断检验冷冻组织检验前过程的规范》的第2部分。本文件等同采用ISO20184-2:2018《分子体外诊断检验冷冻组织检验前过程的规范第2部分：Ⅱ1GB/T22576.1—2018医学实验室质量和能力的要求第1部分：通用要求(ISO15189:2012,2原始样品primarysample3本文件中指18℃~25℃。样品sample通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定。[来源：GB/T19000—2016,[来源：GB/T19000—2016,44通则剂和消耗品应符合GB/T22576.1—2018中5.3、GB/T22576.1—2018中和的要求；GB/T27020—2016中6.2也能适用。诊断工作流程的所有步骤都能影响最终分析测试结果。应验证和确认整子稳定性和样品贮存条件。应记录不能完全控制的工作流程步骤(例如，热缺血),并应进行风险评估在开发和实施检查测试之前，宜在整个检验前过程中检测待检验的特定蛋白降解等原因而发生改变。这些变化取决于冷冻和冷缺血持续时间以及冷冻前的环境温度。此外，这些应遵循运送和处理的安全说明(见GB/T22576.1—2018中5.2.3和5.4.5以及GB19781)。另见GB/T22576.1—2018中5.4.4。文件记录应包括标本供体/患者信息(ID),可能是代码形式。别等);c)标本供体/患者的相应的知情同意。5GB/T42080.2—2022/ISO20184-2:2018a)通过记录与缺血相关的血管结扎/夹闭时间点(通常为动脉夹闭时间)来表示体内缺血开始(热缺血);如果在实验室外进行组织冷冻，则应记录6.2中描述的步骤，需要进行需要冷冻用于诊断目的的组织可能来自大的组织样本，也可能来自像活检这类小的组织标本(例如，通过内窥镜检查获取的标本，或者在需要快速冷冻切片诊断的外科标本)。如果标本需要进行病理诊断，则应由具有医师资格的病理医生采样(见6.2)。如果在没有病理诊断要求的情况下取出标本，评估标本的选择和记b)如果标本或样品在实验室内冷冻，则需要将新鲜的组织标本运送到实验室。应立即执行5.25.2.2运送准备6GB/T42080.2—2022/ISO20184-2标本宜从身体移除后立即转移到容器中。然后宜将容器保存在冰上或2℃~8℃条件下，以减少度范围宜按环境温度、室温或2℃~8℃估算。如果标本尚未冷冻，宜立即置于冰上或维持温度在2℃~8℃情况下进行即时运送，以尽量减少蛋标本病理学的评估和记录以及从标本中选择用于进一步处理的样品应由取合适的标本部分，以确保用于蛋白质检验的样品采集不会影响组织病理学检验。分子检验信息和问题相关联。应描述标本中所示的解剖学定位，必要时可标记切除边缘和其他重要区用的冷冻介质。应由具有资质的病理医师对冷冻切片进行评估。应根据各医学学会的器官/76.3.1应立即冷冻标本或样品。宜选择和使用标本或样品中关于预期用途和工作条件的最佳冷冻方6.3.2三种可能的冷冻程序如下。a)急速冷冻程序[12]:这种方法宜优选，它可以最好地保存冷冻组织样品中的形态。异戊烷(C₅H₁₂,也称甲基丁烷或2-甲基丁烷)应预冷，温度范围为≤-80℃至>-160℃,能用于快些设备可在控制或不控制冷却速率的情况下使异戊烷保持在≤-80℃。异戊烷应在管子或在组织冷冻后，应将其转移到指定的预冷标记的低温小瓶中。应按照制异戊烷在室温和压力下是极易挥发且极易燃的液体。因此，实验b)快速冷冻程序：组织应在预先冷却的金属板或置于液氮表面的金属篮上或干冰上快速冷冻。金属表面应预冷，温度范围为≤-80℃至>-196℃。能使用合适的支架和夹具将金属板或的选定部分应冷冻到适当的冷冻介质中安装在低温恒温器上的专用金属网格上。宜记录使用的冷冻介质。通过将金属保持在液氮或干冰中直至组织冷冻来冷冻含有组织和冷冻介建议标本/样品在一个维度上不超过1cm。1)容器应具有足够的体积以容纳标本或样品；2)容器应经过贮存温度认证；3)容器应安全密闭，最好用螺帽固定；不应使用带4)容器应适合在冷冻贮存条件下进行永久性标记。8GB/T42080.2—2022/ISO1)标本供体/患者的信息(ID),独特的标本/样品唯一信息(ID)和采集标本和/或样品的日9GB/T42080.2—2022/ISO(资料性)蛋白质定量检测显示冷缺血过程中蛋白质含量的变化”A.1概述磷酸化和脱磷酸化是细胞内和细胞间信号转导的关键机制，反映细胞的活本研究的结果为患者间变异性以及临床组织样品中蛋白质和磷蛋白分布蛋白的随后分离和存储标准化。这一标准化过程包括记录热缺血报道了热缺血的结果(见A.2.4),但这里显示的数据表明冷缺血持续时间对蛋白质谱有影响。因此，有A.2示例A.2.1概述在一项时间过程试验中，研究人员利用人体的肠和肝组织来评估长期冷缺血A.2.2试验步骤使用相同的工作流程在不同的医院收集人肠和肝组织。血管结扎(t₁)和手术切除(t₂)之间的时间对在室温下加湿室中贮存的样品进行试验延迟至冷冻(3)和t₃作为参考样品的时间过程试验，其中在GB/T42080.2—2022/ISO20184-图A.1组织收集概述为了研究冷缺血时间对蛋白质和磷蛋白量的影响，在常规外科手术过程中收集非恶性人肠和肝脏样品。标本在室温下运送到病理学研究所进行进一步处理。将每个样品分成最小尺寸为5mm×5mm×5mm的样品，并在液氮中快速冷冻。参考样品在到达病理学实验室后立即冷冻(见图A.1中t₃)。将所有其他样品在室温下保持在加湿室中30min～360min,模拟试验延迟至冷冻(见图A.1)。应用反相蛋白质阵列(RPPA)和蛋白质印迹分析作为靶特异性方法来分析单个蛋白质和某些磷酸化蛋白质的量。使用的抗体列于表A.1中。表A.1应用反相蛋白质阵列和蛋白质印迹分析所用抗体蛋白质(n=23)物种GB/T42080.2—2022/ISO20184-表A.1应用反相蛋白质阵列和蛋白质印迹分析所用抗体(续)蛋白质(n=23)物种Phospho-p44/42MAPK(Thr202Phospho-p38MAPK(Thr180NF-kappaBp65A.2.3结果为了研究冷缺血时间对蛋白质谱的影响，在常规操作程序期间收集人非恶性组织标本(n=11)并运送到病理学实验室，其中在到达时开始受控的时间过程试验。在蛋白质分离后，通过具有23种特异性抗体的反相蛋白质阵列(RPPA)定量分析所选蛋白质的稳定性，其中7种针对磷酸化表位，并且一种识别切割的蛋白质。基于它们在关键细胞功能或信号传导途径中的潜在参与来选择蛋白质，例如，细胞结构、增殖和存活、应激反应、缺氧、细胞凋亡和黏附。研究人员认为通过分析蛋白质切割和翻译后修饰(磷酸化),能够可靠地确定缺血期间蛋白质和磷蛋白水平的潜在波动。图A.2试验性延迟冷缺血期间蛋白质和磷蛋白的分析GB/T42080.2—2022/ISOGündisch,S.,Hauck,S.,Sarioglu,H.etal.Variabilityofproteinandphosphoproteinlevelsinclincaltissuespecimensduringthepreanalyticalphase.Journa[1]GB/T15000.2—2019标准样品工作导则第2部分：常用术语及定义[2]GB/T19000—2016质量管理体系基础和术语[3]GB19781医学实验室安全要求[4]GB/T21415—2008体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的[5]GB/T27020—2016合格评定各类检验机构的运作要求[6]JungblutP.,ThiedeB.,Zimny-arndtU.Resolutionpoweroftwo-dimensionalelecandidentificationofproteinsfromgels.Electrophoresis[7]StolermanIP.ed.EncyclopediaofPsychopharmacology.Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg,[8]GüindischS.HAUCK,S.,SARIOGLU,H.etal.Variabilityoflevelsinclinicaltissu[9]EspinaV.,EdmistonK.H.,HeibyM.Aportraitoftissuephosclinicaltissueprocurementprocess.Mol.Cell.Proteomics.20[10]GündischS.,Grundner-CulemannK.,WolffC.Delayedtpredictableglobalphosphoproteomechanges.J.ProteomeRes.2013,12(10)pp.4424-4434[11]CondelliV.,LettiniG.,PatitucciG.Validationofvacuum-basedrefrigeratedbiobankingtissuepreservation:analysisofcellularmorphology,proteinstapreserv.Biobank.2014,12(1)pp.35-offreshfrozentissuesamples.Eur.J.Cancer.2[13]GottfriedB.S.,LeeC.J.,BellK.J.TheLeidenfrostPhenomenon:FilmBoilingDropletsonaFlatPlate.[14]WHO/IARCClassificationofTumourson.http://wh[15]GallagherSR2010,Proteinblotting:Immunoblotting,currentprotocolsEssentialLtoryTechniques.4:8.3.1-8.3.36.C2010byJohnWileyandSons,Inc.[16]OlsonBJ.SC.,Markwell,J.Assaysfordeterminationofproteinctocolsessentiallaboratorytec