免疫学检测技术专家讲座

第十五章

免疫学检测技术

IMMUNOLOGICALTECHNIQUES广州医科大学中法霍夫曼研究所B1-207李孜37103800（O）免疫学检测技术第1页抗原-抗体反应免疫细胞检测免疫分子检测免疫检测方法应用内容免疫学检测技术第2页抗原-抗体反应特点抗原-抗体反应原因抗原-抗体反应检测技术第一节抗原-抗体反应免疫学检测技术第3页1.高度特异性:抗体亲和力、交叉反应2.可逆性：非共价结合（氢键、疏水键等）亲和力；适当环境原因3.百分比性：最适百分比才能可见两阶段：

特异性结合阶段：抗原-抗体互补结合可见反应阶段：大复合物一、抗原抗体反应特点**免疫学检测技术第4页百分比性免疫学检测技术第5页1.抗原抗体性质：关键原因

抗体特异性、亲和力；抗原、抗体浓度2.温度

37℃最适温度3.溶液pH值最正确6-84.电解质：抗原抗体等电点为pH3-5或4-6不等。使抗原抗体复合物失去电荷而聚集二、抗原抗体反应影响原因**免疫学检测技术第6页三、抗原抗体反应检测技术凝集反应沉淀反应免疫标识技术蛋白质芯片技术免疫学检测技术第7页（一）凝集反应（agglutination）**

颗粒性抗原+对应抗体（细菌、螺旋体、细胞或表面包被抗原颗粒状物质）适量电解质 百分比适当

凝集颗粒

肉眼可见Ag-Ab复合物免疫学检测技术第8页玻片凝集试验：为定性试验，用于判定抗原，如菌种判定、ABO血型判定等1.直接凝集反应(directagglutinationreaction)试管凝集试验：为半定量试验，用于检测抗体效价，如诊疗伤寒、副伤寒肥达试验1.1原理：1.2分类：免疫学检测技术第9页2.间接凝集反应(indirectagglutinationreaction)(正向)间接凝集反应：检测未知Ab,如类风湿因子检测反向间接凝集反应：检测未知Ag，如早孕诊疗HCG2.1原理：将可溶性抗原或抗体吸附于一些载体颗粒上，形成致敏颗粒，然后与对应抗体或抗原进行反应而产生凝集现象2.2分类免疫学检测技术第10页3.协同凝集反应(co-agglutinationreaction)将抗体IgGFc段结合至葡萄球菌A蛋白（SPA），葡萄球菌表面Fab段与抗原结合，使葡萄球菌凝集原理实际是反向间接凝集反应：载体是葡萄球菌S.aureusAb免疫学检测技术第11页（二）沉淀反应（precipitation）**血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与对应抗体→→出现可见沉淀物一定条件下免疫学检测技术第12页1.单向琼脂扩散（单扩）可用于血清中免疫球蛋白、C3、AFP或其它可溶性抗原定量测定免疫学检测技术第13页免疫学检测技术第14页2.双向琼脂扩散试验（双扩）应用可用于抗原或抗体定性、定量及组分分析1234567免疫学检测技术第15页3.免疫电泳应用：对各种抗原成份复合物进行抗原种类分析，如对血清蛋白组分分析，用于骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症辅助诊疗免疫学检测技术第16页4.速率散射比浊法/免疫比浊法原理:是在一定抗体中分别加入递增量抗原,经一定时间后形成免疫复合物，使反应体系展现不一样浊度。用浊度仪测量液体浊度，可依据标准曲线推算样品中抗原含量。优点：快速、简便,取代了传统环状沉淀和絮状

沉淀反应。应用:检测前白蛋白、α2巨球蛋白、尿微量蛋白及血清IgG、IgA、IgM和补体等免疫学检测技术第17页(三)免疫标识技术概念：免疫标识技术是将抗原抗体反应与标识技术相结合，以检测抗原或抗体一类试验方法。惯用标识物：荧光素、酶、放射性核素、胶体金及化学发光物质等优点：灵敏度高、快速，可定性、定量甚至可定位检测。免疫学检测技术第18页惯用免疫标识技术：酶免疫测定法（EIA）免疫荧光技术（IFA）放射免疫测定法（RIA）化学发光免疫技术（CLIA）免疫胶体金技术免疫印迹法(Westernblotting)免疫PCR酶荧光素放射性核素化学发光物质胶体金颗粒免疫学检测技术第19页酶免疫测定法**（enzymeimmunoassay，EIA）是用酶标识抗体进行抗原抗体反应。其将抗原抗体特异性与酶高效催化作用相结合，经过酶作用于底物后显色来判定结果。惯用酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等惯用方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织或细胞中抗原。免疫学检测技术第20页1)酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）既可检测抗原，又可检测抗体简便、快速，灵敏度高，应用最广泛ELISA法包含：双抗体夹心法、间接ELISA、BAS-ELISA和微粒捕捉酶免疫分析技术（MEIA）等。免疫学检测技术第21页包被一抗加入抗原加入酶标一抗加入反应底物 测量光密度洗涤洗涤洗涤ELISA双抗体夹心法示意图免疫学检测技术第22页12345678免疫学检测技术第23页生物素-亲和素系统-ELISA（biotin-avidinsystem-ELISA，BAS-ELISA）生物素（biotin，B）：辅酶R或者维生素H亲和素（avidin，A）：碱性糖蛋白，一个亲和素分子可结合四个生物素分子Ag免疫学检测技术第24页2)免疫组化技术（IMMUNOHISTOCHEMISTRYASSAY,IHC）免疫学检测技术第25页2.免疫荧光法**（immunofluorescenceassay,IFA）是用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发荧光，借此对标本中抗原作判定和定位。惯用荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）：发黄绿色荧光藻红蛋白（PE）：发红色荧光免疫学检测技术第26页直接免疫荧光与间接免疫荧光免疫学检测技术第27页激光共聚焦显微检测+IFA免疫学检测技术第28页3.免疫印迹技术(WESTERNBLOTTING)免疫学检测技术第29页4.放射免疫测定（RADIOIMMUNOASSAY,RIA）放射性核素标识抗原或抗体优点：高度灵敏性，可进行超微量分析缺点：有放射性危害免疫学检测技术第30页5.化学发光免疫分析（CHEMILUMINESCENCEIMMUNOASAY,CLIA）化学发光物质标识抗原或抗体：吖啶酯或鲁米诺灵敏性高，操作简便luminol+hydrogenperoxide→3-APA[◊]→3-APA+light免疫学检测技术第31页6.免疫胶体金技术（IMMUNOGOLDLABELINGTECHNIQUE）胶体金颗粒标识抗原或抗体广泛用于快速检测试剂盒（HBsAg,HCG等）已结合有Ag已结合有抗抗体免疫学检测技术第32页7.蛋白质芯片技术（抗原芯片、

抗体芯片）免疫学检测技术第33页8.免疫PCR（IMMUNO-PCR）PCR：聚合酶链式反应，polymerasechainreactionDNA分子标识免疫学检测技术第34页外周血单个核细胞分离T、B淋巴细胞分离淋巴细胞功效检测

第二节免疫细胞检测免疫学检测技术第35页一、外周血单个核细胞（PBMC）分离**葡聚糖-泛影葡胺（淋巴细胞分离液）密度梯度离心法分离PBMC免疫学检测技术第36页二、淋巴细胞及其亚群分离（一）免疫吸附分离法(淘选法)

将已知针对细胞表面标志抗体包被培养皿,加入淋巴细胞悬液,表示对应表面标识细胞即与对应抗体结合,而贴附于固相载体上从而与悬液中其它细胞分开.免疫学检测技术第37页利用表面标志分离淋巴细胞（淘选法）免疫学检测技术第38页（二）免疫磁珠法（immunemagneticbead,IBM）

将已知抗细胞表面标志抗体交联于磁性微珠（平均直径<1.5μm),即成为免疫磁珠,将其与细胞悬液反应后,磁珠借抗体结合于对应细胞群或细胞亚群表面.再将细胞悬液加于一试管内并置磁场中,因免疫磁珠被磁场吸引,就可将免疫磁珠结合细胞与未结合细胞分离开来。如借此可分离取得高纯度淋巴细胞.阳性分离法阴性分离法免疫学检测技术第39页MACS微珠进行磁性标识未标识细胞

先行流出洗脱阳性分选细胞免疫磁珠分离(IMB):淋巴细胞亚群免疫学检测技术第40页（三）荧光激活细胞分离仪分离法(FACS)又称流式细胞术(flowcytometry,FCM）

集光学、流体力学、电力学、计算机技术于一体，可对细胞进行多参数定量测定和综合分析，并可进行分选。速度快、精度高、准确性好免疫学检测技术第41页免疫学检测技术第42页（四）抗原肽-MHC分子四聚体技术原理:用生物素化抗原肽-MHCI类分子复合物与荧光标识亲和素（抗生物素蛋白）结合,因为1个荧光素标识亲合素可结合4个生物素分子,能使4个抗原肽-MHCI类分子复合物形成一个复合体,将该复合体标识荧光素后,即成抗原特异性四聚体.该四聚体能与样品中特异性T细胞TCR结合,因为四聚体能同时结合一个T细胞表面4个TCR,亲和力大大提升.应用:可判定表示抗原特异性TCRT细胞亚群**免疫学检测技术第43页抗原肽－MHC分子四聚体技术免疫学检测技术第44页三、免疫细胞功效测定（一）T细胞功效测定1.T细胞增殖试验PHA、ConA等丝裂原以及抗CD3单克隆抗体等能非特异地活化培养T细胞使其淋巴母细胞化，并使其增殖。在此过程中，细胞DNA、RNA、蛋白质合成增加，细胞形态改变，最终细胞分裂。形态计数法形态改变[3H]-TdR掺入法DNA复制MTT比色法代谢增强

免疫学检测技术第45页迟发型（IV型）超敏反应（DTH）检测——皮试法，用于检测T细胞功效原理：外来抗原刺激机体后，再用相同抗原做皮试。阳性反应：皮试24~72小时出现局部红肿硬结（效应T细胞与特异性抗原结合作用后，引发以单核细胞浸润和组织损伤为主要特征炎症反应）免疫学检测技术第46页（二）细胞毒试验检测CTL、NK等杀伤靶细胞活性方法：51Cr释放法：金标准，51Cr与胞内蛋白稳定结合乳酸脱氢酶（LDH）释放法：正常细胞不会释放LDH细胞凋亡检测**形态学检测法琼脂糖凝胶电泳法TUNEL法流式细胞术（FCM）免疫学检测技术第47页DNAladdersTUNELaasay免疫学检测技术第48页（三）B细胞功效测定血清Ig含量检测：单向琼脂扩散试验、ELISA、免疫比浊法检测IgG、IgA、IgM含量2.抗体形成细胞测定

(1)溶血空斑形成试验

免疫学检测技术第49页（2)酶联免疫斑点测定（ENZYME-LINKEDIMMUNOSPOTASSAY,ELISPOT）检测B细胞产生抗体或者细胞分泌CK免疫学检测技术第50页（四）吞噬细胞功效测定2.氯化硝基四氮唑蓝(NBT)试验

NBT是一个水溶性淡黄色染料，被吞噬细胞吞入胞浆后，可被胞内产生反应性氧中间物–超氧阴离子（O-2）还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中，光镜下计数NBT阳性细胞，可反应中性粒细胞杀伤功效。1.巨噬细胞吞噬试验免疫学检测技术第51页（五）细胞因子检测生物学活性检测法分子生物学检测免疫学检测法①ELISA(双抗体夹心法)检测分泌细胞因子②流式细胞术:检测胞内细胞因子③酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测： 可检测T细胞产生细胞因子和B细胞分泌特异性抗体免疫学检测技术第52页第三节免疫学检测方法应用一、免疫学检测方法评定与选择金标准真、假阳性真、假阴性特异性＝真阴性/（真阴性＋假阳性）×100％敏感性＝真阳性/（真阳性＋假阴性）×100％

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-+resultfact免疫学检测技术第53页

二、疾病诊疗

应用已知Ab（或Ag）检测未知Ag(或Ab），从而为感染性和非感染性疾病提供诊疗或辅助诊疗1、传染病实例：

细菌性疾病:应用直接试管凝集反应辅助诊疗肠热症(肥达反应)、布氏病(瑞特试验)

病毒性疾病:HBV感染诊疗-ELISA检测乙肝“两对半”

HIV感染诊疗：初筛-ELISA、RIA检测HIV抗体 确诊：免疫印迹技术检测HIV抗体2、免疫缺点病实例：

抗体缺点：免疫比浊法检测Ig（Bruton病）吞噬细胞功效缺点：NBT试验辅助诊疗CGD

补体缺点：检测C1INH-遗传性血管神经性水肿诊疗免疫学检测技术第54页3.本身免疫病实例SLE:初诊-检测抗