加强微生物监测提高抗感染治疗水平专家讲座

加强微生物监测、提升抗感染治疗水平安徽省细菌耐药监控中心安徽医科大学临床检验诊疗学教研室安徽医科大学第一从属医院检验科徐元宏加强微生物监测提高抗感染治疗水平第1页一、正确留取标本是取得准确结果前提1.血液、骨髓、无菌体液：（1）严格消毒、防止体表正常菌群污染。（2）应在抗生素使用之前抽血。假如病人已使用抗生素，应选择含中和剂（活性炭、中性树脂）培养瓶，或在下次用药前采血。（3）因为血液、骨髓、无菌体液含有极少许病原体，就能够造成感染性疾病，而试验室检出率与病原体数量相关，并非只要有病原体就能检验出来，所以血液、骨髓、无菌体液等必须增菌才能取得满意结果。成人未使用抗生素治疗采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水、关节液3-10毫升接种成人培养瓶（蓝盖）；成人已使用抗生素治疗采集上述标本接种加中性树脂培养瓶（灰盖）；儿童采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水，关节液1-3毫升接种儿童培养瓶（红盖）；厌氧培养接种上述标本3-10毫升于厌氧培养瓶（黄盖）。（4）因为菌血症、败血症是间歇排菌，应在发烧高峰时采血，对于感染性心内膜炎患者增加采血次数，以提升阳性率。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第2页加强微生物监测提高抗感染治疗水平第3页2.导管相关性血流感染（CRBSI）血培养（1）第一采集方法经外周静脉穿刺采血》1套（送两个培养瓶）；从导管中心或静脉留置口隔膜采血1套，二者采血时间应该靠近（《5分钟）。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第4页结果解释：（a）依据细菌判定和药敏试验确认，若两套阳性血培养是同一个细菌，又没有其它部位感染，提醒CRBSI；（b）若两套阳性血培养瓶是同一个细菌，从导管采血血培养汇报阳性时间比外周静脉穿刺采血早》120分钟，又没有其它部位感染，提醒CRBSI；加强微生物监测提高抗感染治疗水平第5页（c)依据细菌判定和药敏试验确认，若两套阳性血培养是同一个细菌，又没有其它部位感染，从导管采血血培养汇报阳性时间比外周静脉穿刺采血不足120分钟，提醒CRBSI；（d）若外周静脉穿刺采血血培养是阴性，只有导管采血血培养是阳性，不能定为CRBSI；加强微生物监测提高抗感染治疗水平第6页（e）若只有外周静脉穿刺采血血培养是阳性，但分离菌为金黄色葡萄球菌或念珠菌，且没有任何其它部位感染证据，提醒高度可疑为CRBSI；（f）若再次导管采血/外周采血，若培养阳性，且是同一个细菌，可定为CRBSI；加强微生物监测提高抗感染治疗水平第7页（2）第二种采集方法：外周静脉穿刺采血采集1～2套，同时拔出导管，用Maki导管平皿滚动法，对导管尖片段进行半定量培养。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第8页结果解释：（a）假如两套外周静脉穿刺采血培养是阳性，导管片段培养为阳性（》15CFU/平皿），提醒为CRBSI；（b）假如两套外周静脉穿刺采血培养是阴性，导管片段培养为阳性，提醒可能为导管上定植菌，不支持CRBSI；加强微生物监测提高抗感染治疗水平第9页（c）若全部血培养和导管片段培养是阴性，不太可能是CRBSI；（d）假如有》1套血培养是阳性，导管片段培养是阴性，但分离株是金黄色葡萄球菌或念珠菌，且没有任何其它部位感染证据，提醒仍有可能是CRBSI。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第10页3.尿液：（1）导尿法：是一个很好无菌采集法，主要适合用于手术后患者，取10-15毫升尿液于无菌容器内送检，但留置导尿管易造成医院内感染。（2）中段尿采集法：是临床上最多采取方法，女性病人先以肥皂水或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗外阴及阴道口；男性病人应翻转包皮冲洗，用1：1000新洁尔灭消毒尿道口，在用无菌纱布擦干，让病人排尿，弃去前段尿，搜集中段尿10—20ml，盛于无菌容器内，马上加盖送检。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第11页（3）肾盂尿采集法：为确定菌尿是否来自肾脏，可用导尿管采集肾盂尿。首先充分冲洗膀胱，以最终一次冲洗尿作对照，后用导尿管插入输尿管，分别标识左右侧，搜集3次尿；假如输尿管菌数比对照尿菌数多或第3次尿中菌数比第1次多，该菌尿可能来自肾脏。反之，假如第1次尿菌数多于第3次尿菌数，则可能来自膀胱。肾盂尿采集法普通应该请泌尿科医师帮助进行，并确实做好标识，以防左右侧搞错。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第12页（4）膀胱穿刺尿采集法：将病人耻骨上皮肤碘酒、酒精消毒后，以无菌针筒作膀胱穿刺。此法主要用于尿液中厌氧菌培养，故在取得尿液后，针头插于橡皮塞上送检。当儿童或婴儿采集中段尿困难或培养结果与患者病情有矛盾时，可考虑用此法采集尿液。（5）留尿法：尿液检验结核分枝杆菌时，可用一洁净容器，留取24h尿液，取其沉淀部分200-250毫升盛于清洁瓶内送检。试验室人员接收后应全部离心，涂片镜检。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第13页4.痰液：正常人下呼吸道是无菌，上呼吸道有正常菌群借居。下呼吸道分泌物必须经过上呼吸道，常受上呼吸道正常菌群污染。所以对于下呼吸道分泌物培养出来结果必须分析、判断。普通要求病人清晨用无菌生理盐水漱口6次，再用冷开水漱口一次，用力咳深部痰液于无菌容器内送检，防止口水污染。对于痰液不能自主咳出，可采取高渗盐水雾化吸入排痰。

加强微生物监测提高抗感染治疗水平第14页试验室在收到痰标本，涂片革兰染色（SEC<10/LPF，WBC>25/LPF）可做细菌培养，统计涂片结果，SEC>25/LPF，WBC<10/LPF，视为污染，提议重留标本；介于二者之间做细菌培养，统计涂片结果，结合培养后细菌数量考虑是否是致病菌。合格痰标本用无菌生理盐水约20毫升漂洗2次，用等量sputosol作用20分钟。用接种环四区划线，从一区到另一区应灭菌，接种直径9厘米血平板两块，巧克力平板一块，沙包氏培养基。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第15页置CO2环境下培养。从采集标本到接种应在2小时内完成。未发觉致病菌，再培养72小时。若怀疑结核感染找抗酸杆菌，应搜集二十四小时痰液于清洁玻璃容器内。若怀疑放线菌感染，应让病人留取含有颗粒痰液，试验室查到硫磺颗粒且弱抗酸，能够考虑放线菌感染。若怀疑口腔正常菌群紊乱或口腔霉菌感染，能够用无菌棉签取咽峡部分泌物于无菌容器内送检。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第16页5.皮肤、创面：首先按常规消毒皮肤，然后用无菌注射器抽吸皮下病变部分，或用无菌棉签取痂下脓性分泌物。6.生殖道分泌物：依据病人主述临床症状，采取不一样方式取材：若病人白带呈淡黄色，稀水样，考虑滴虫感染，用无菌棉签取阴道分泌物于1毫升生理盐水内送检，注意保温，因为当前滴虫检验主要看鞭毛摆动动力。若病人白带呈“豆腐渣”样，烧痒症状，用无菌棉签取“豆腐渣”样白带送检，选择不一样送检方式和检验方法可取得不一样检验结果，其方法有生理盐水直接镜检、涂片加NaOH破坏上皮细胞镜检、革兰染色镜检，普通认为革兰染色镜检是较为理想方法。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第17页对于口腔、阴道等部位因为采取染色方法提升酵母菌检验灵敏度，对于是定植还是致病，当前缺乏诊疗依据。若怀疑淋病患者，对于男性急性患者，用一支棉签檫去尿道口脓液，轻轻挤压尿道口，再用一支棉签取其脓液；对于男性慢性患者或治疗后复查患者，用一支棉签伸入尿道口2-4厘米，停留数秒钟，旋转取出，因为尿道口借居是鳞状上皮细胞，尿道2-4厘米借居是柱状上皮细胞，这是淋球菌借居地方。对于女性患者，用温水湿润扩阴器，取阴道分泌物或宫颈分泌物，棉签停留数秒钟，让棉签充分吸附分泌物。从直肠取材时，应将棉签插入肛门2.5厘米以上，碰到粪便，应换一个棉签重取。检验淋球菌性咽炎时，应从扁桃体及扁桃体窝取材。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第18页支原体检验：支原体是简单原核细胞，没有细胞壁，缺乏许多细胞器，直接镜检没有意义，只有经过培养，取材显得主要，采集标本时，男性患者可用尿道拭子或清晨中段尿培养，女性推荐阴道拭子。衣原体检验：采取尿道标本，最少在排尿1小时后采集，对于男性尿道取材，棉拭子应伸入尿道2-4厘米（因为衣原体寄生在粘膜柱状上皮细胞，而不是寄生在复层鳞状上皮细胞中），转动拭子以取得细胞；对于女性尿道取材，先用一个拭子擦净尿道口，再用棉拭子加强微生物监测提高抗感染治疗水平第19页（小）伸入尿道2厘米，轻轻转动拭子取出，对于女性宫颈取材，用温水湿润扩阴器扩张阴道，先用一个拭子擦净宫颈口，然后再用棉拭子（小）伸入宫颈内1-2厘米，用力摩擦采取宫颈细胞，不采取脓液作培养。直肠取材，可将拭子插入肛门括约肌，在肛门和直肠结合处沿肠壁转动，连续10-30秒，以吸收微生物，并防止粪便污染。尿液、精液、服过抗生素病人标本以及新近用过一些阴道制剂、清洁剂等病人标本不宜作衣原体检验。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第20页二、正确检验病原体1.及时接种，选择适当培养基：因为体外环境不是微生物生长最适宜环境，微生物怕冷、热、光、干燥、消毒剂，所以试验室接收标本后，应马上接种；不一样微生物需要不一样营养要求和环境，选取不一样培养基，制备不一样环境，比如解脲支原体需要解脲支原体培养基，脑膜炎奈瑟氏菌需要营养丰富巧克力血平板和5-10%CO2，淋球菌需要Thayer-Martin（T-M）、NYC培养基和5-10%CO2。除此之外，为了更加好分离致病菌、抑制正常菌群和污染菌，需要加入一些营养因子和抑菌剂。比如淋球菌T-M培养加入血红蛋白、万古霉素、多粘菌素、制霉菌素、磺胺嘧啶。万古霉素抑制葡萄球菌生长，多粘菌素抑制铜绿假单胞菌生长，制霉菌素抑制念珠菌生长，磺胺嘧啶抑制变形杆菌生长。有利一面，利于淋球菌识别；不利一面是遗漏可能致病菌，患者易产生继发感染：继发霉菌性阴道炎、淋病治愈后葡萄球菌性尿道炎。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第21页2.怎样将含量少病原体检验出来？及时接种，防止微生物死亡。一些感染必须增菌，以取得足够数量病原体，血液、骨髓、胸水、腹水、脑脊液、关节液等必须接种到增菌培养基上。选取营养丰富培养基、提供适宜环境，满足不一样病原体要求。采取灵敏方法检测病原体。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第22页3.怎样从众多正常菌群中区分致病菌？采取营养丰富培养基和适宜环境满足致病菌生长。采取含抑制剂培养基筛选致病菌。如解脲支原体培养基除含小牛血清外，还含有青霉素；分离大肠埃希氏菌O157，H7所用培养基是山梨醇麦康凯培养基。利用丰富、扎实知识识别致病菌。对于痰液：致病菌是脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、奴卡菌；可能致病菌是念珠菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌（指除凝固酶阳性金黄色葡萄球菌之外全部凝固酶阴性葡萄球菌统称，当前包含31个种，是一个习惯称法）、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、卡他粘膜炎奈瑟菌等。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第23页普通不是致病菌是指草绿色链球菌。对于尿液：分离到两种以下细菌，可能是病人借居细菌，若分离到三种或三种以上，可能是污染菌，提议病人重新留取标本。在汇报细菌同时，应汇报菌落计数，过去认为对于革兰阴性杆菌≥105

CFU/ml有致病意义，革兰阳性球菌≥104

CFU/ml有致病意义；现在认为只要病人有主述症状，菌落计数≥100CFU/ml就有致病意义。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第24页4.正确认识菌体形态和菌落形态经过革兰染色将细菌分为：革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌。因为该法简单、快速，广泛用于微生物检验。在无菌部位出现对应细菌，帮助我们用药，在有菌部位，帮助我们分析是否菌群紊乱。经过抗酸染色将细菌分为：抗酸杆菌和非抗酸杆菌，对于经过痰液排菌肺结核患者、皮肤麻风患者、结核性脑膜炎患者有较大帮助。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第25页经过墨汁染色能够直接判断有没有新型隐球菌感染。菌落特征有突起、凹陷、色泽、色素等表面特征：肺炎链球菌展现肚脐样凹陷，沙雷氏菌出现红色色素，铜绿假单胞菌有绿色、无色色素，有姜味气味，可展现粘液型菌落、粗糙型菌落、光滑型菌落。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第26页加强微生物监测提高抗感染治疗水平第27页加强微生物监测提高抗感染治疗水平第28页加强微生物监测提高抗感染治疗水平第29页5.正确判别病原菌对于细菌而言，主要依据表型特征，菌体、菌落形态，溶血性、生化反应，血清凝集将细菌判定。革兰阳性球菌中葡萄球菌主要依据凝固酶、新生霉素抑菌试验、生化反应来判断；肠球菌依据6.5%NaCL、胆汁七叶苷与葡萄球菌、链球菌判别，依据甘露醇、山梨醇、山梨糖、精氨酸、阿拉伯糖、棉子糖、动力、黄色素、蔗糖、丙酮酸盐来判别属内12个种；链球菌属依据cAMP、DNA、杆菌肽、血清凝集来判别。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第30页革兰阴性球菌主要依据氧化酶、DNA酶、生化反应来判别，淋球菌氧化酶阳性、DNA酶阴性、葡萄糖阳性、乳糖阴性、麦芽糖阴性、甘露糖阴性、蔗糖阴性；脑膜炎奈瑟氏菌氧化酶阳性、DNA酶阴性、葡萄糖阳性、乳糖阴性、麦芽糖阳性、甘露糖阴性、蔗糖阴性。革兰阳性杆菌主要依据菌体、菌落，特征性染色来判别，结核分枝杆菌抗酸染色阳性，白喉棒状杆菌Albert染色出现异染颗粒，产单核李斯特菌溶血性和动力。革兰阴性杆菌主要依据氧化酶、氧化-发酵（O-F）试验来判断。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第31页氧化酶阴性、氧化-发酵（O-F）发酵肠杆菌科编码补充生化反应判定到种。对于致病性大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌还需血清学凝集。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第32页氧化酶阴性、氧化-发酵（O-F）氧化非发酵菌编码氧化酶阳性、氧化-发酵（O-F）氧化/-补充生化反应判定到种。氧化酶阳性、氧化-发酵（O-F）发酵弧菌科编码补充生化反应、血清学凝集判定到种，如霍乱弧菌O1、O139等。对于真菌而言，主要依据菌体形态、菌落形态、色素，同化试验、发酵试验来判别至种属。试验室人员迷惑：因为上述细菌、真菌判定依靠表型特征，表型是受基因控制，同一基因型可能有不一样种表型，同一表现型可能受不一样基因型所控制。依据表现型判断菌体能代表真正菌属吗？伴随分子生物学发展，人们能任意改造表现型。我们能有所作为吗？加强微生物监测提高抗感染治疗水平第33页三、恰如其分汇报药敏结果药敏试验中药敏纸片选取：临床医生经常反应，试验室所汇报药敏试验结果，临床根本或极少使用这类药品，试验室药敏试验中药品是敏感，临床使用无效。怎样联适用药、合理用药？试验室人员应依据可能细菌种类、细菌菌属，合理选取药敏纸片，汇报检验结果。试验室应依据美国FDA推荐临床微生物试验室苛养菌和非苛养菌分组药品选取，它将药品分为四组：A组，一级试验并常规汇报抗生素；B组，一级有选择汇报抗生素；C组，补充试验，有选择汇报抗生素；U组，用于泌尿道补充试验药品。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第34页比如对于肠杆菌科细菌常规汇报抗生素有氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻吩、庆大霉素；选择汇报抗生素有阿米卡星、阿莫西林/棒酸或氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、头孢孟多或头孢尼西或头孢呋辛、头孢吡肟、头孢美唑、头孢哌酮、头孢替坦、头孢西丁、头孢噻肟或头孢唑肟或头孢曲松、环丙沙星或左氧氟沙星、亚胺培南或美罗培南、美洛西林或哌拉西林、替卡西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第35页对于铜绿假单胞菌和不动杆菌常规汇报抗生素有头孢他啶、庆大霉素、美洛西林或替卡西林、哌拉西林，选择汇报抗生素有阿米卡星、氨曲南、头孢哌酮、头孢吡肟、环丙沙星、亚胺培南或美罗培南、妥布霉素。对于葡萄球菌常规汇报抗生素有苯唑青霉素、青霉素，选择汇报抗生素有阿奇霉素或克拉霉素或红霉素、克林霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、万古霉素。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第36页对于肠球菌常规汇报抗生素有青霉素/氨苄西林，选择汇报抗生素有万古霉素。对于嗜血杆菌常规汇报抗生素有氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，选择汇报抗生素有头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟或头孢曲松、头孢呋辛钠（针剂）、氯霉素、美罗培南。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第37页对于肺炎链球菌常规汇报抗生素有红霉素、青霉素（苯唑青霉素）、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，选择汇报抗生素有格帕沙星、左氧氟沙星或司氟沙星、氧氟沙星、四环素、万古霉素。对于除肺炎链球菌以外其它链球菌常规汇报抗生素有红霉素、青霉素、氨苄西林，选择汇报抗生素有氯霉素、克林霉素、万古霉素、头孢吡肟或头孢他啶或头孢曲松、左氧氟沙星、氧氟沙星、Linezolid、奎奴普汀/达福普汀。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第38页对于淋球菌常规汇报β-内酰胺酶结果，如β-内酰胺酶阳性提醒青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药，但淋球菌更多是染色体介导耐药，需要做补充药敏试验，选择汇报抗生素有头孢克肟或头孢噻肟或头孢泊肟或头孢唑肟或头孢曲松、头孢美唑、头孢替坦、头孢西丁、头孢呋辛、环丙沙星、格帕沙星或氧氟沙星、青霉素、大观霉素、四环素。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第39页遵照严格操作方法、施加质量控制：纸片扩散法（K-B））法、液体稀释法必须遵照NCCLS（CLSI）要求，它对纸片厚度、药品浓度、培养基、培养环境、孵育温度、操作方法都有详细要求。E-test必须按照其说明要求进行。利用丰富理论知识，提醒临床用药：对于肠道分离沙门菌和志贺菌属，常规仅测试氨苄西林、一个喹诺酮类药品和TMP/SMZ药品，1、2代头孢菌素尽管体外敏感，但临床治疗无效，试验室不能做此药敏试验。对于肠道外分离株，沙门氏菌属还一定要测试并汇报氯霉素和某一个三代头孢菌素。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第40页对于MRSA、MRSCON、ESBLs、高耐庆大霉素肠球菌、AmpC-β-内酰胺酶应有所选择性汇报药敏结果，有时体外药敏结果是敏感也要汇报耐药。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第41页1.药敏试验种类和方法：（1）细菌药敏试验纸片扩散法液体稀释法E-test法加强微生物监测提高抗感染治疗水平第42页（2）酵母样真菌药敏试验纸片扩散法液体稀释法E-test法浅部真菌当前尚没有标准方法。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第43页细菌药敏试验-纸片扩散法Kirby-BaueragardiskdiffusionPaperdiskcontainingantibioticisplacedonlawnofbacteria,thenincubatedovernight.DiameterofzoneofinhibitionisinverselyrelatedtoMIC(usedtoestablishinterpretivebreakpoints).Standardizedforcommonlyisolated,rapidlygrowingorganisms.加强微生物监测提高抗感染治疗水平第44页加强微生物监测提高抗感染治疗水平第45页细菌药敏试验-液体稀释法Minimalinhibitoryconcentration(MIC)Referencemethod.Addstandardinoculumtodilutionsofantibiotic.Incubateovernight.MICislowestconcentrationthatinhibitsgrowth(canalsobeperformedbyagardilution).Interpretation(SorR)isbasedonachievabledruglevels104

cfu4210.50.250.120mg/ml加强微生物监测提高抗感染治疗水平第46页细菌药敏试验-E-test法E-testStripscontainingagradientofantibioticareplacedonlawnofbacteriaandincubatedovernight.MICisdeterminedatpointwherezoneofinhibitionintersectsscaleonstrip.CombineseaseofKBwithanMICmethod.ParticularlyusefulforS.pneumoniae.加强微生物监测提高抗感染治疗水平第47页医院内感染菌经常是一些耐药菌，试验室应对这些细菌耐药表型进行检测。肠杆菌科（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、变形杆菌）应作超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）、耐糖肽类抗生素肠球菌（VRE）。四、耐药表型检测加强微生物监测提高抗感染治疗水平第48页1、甲氧西林葡萄球菌检测：MRSA(Methicillin-resistantStaphylococusaureus)、MRSCON（Methicillin-resistantcoagulatase-negativeStaphylococcalspecies）检验：加强微生物监测提高抗感染治疗水平第49页（1）．纸片扩散（K-B）法因为苯唑青霉素较甲氧西林青霉素稳定，不易失活，通常使用苯唑青霉素代替甲氧西林青霉素测定葡萄球菌。M-H琼脂平板，直接菌落悬液法，苯唑青霉素纸片含量为1μg/片，35℃二十四小时孵育，抑菌圈直径《10mm。NCCLS推荐耐甲氧西林葡萄球菌评判标准:采取头孢西丁纸片（30μg）,孵育二十四小时,对于金黄色葡萄球菌抑菌圈≤21mm为MRSA，≥22mm为MSSA;对于凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈≤24mm为MRSCON，≥25mm为MSSCON.加强微生物监测提高抗感染治疗水平第50页加强微生物监测提高抗感染治疗水平第51页(2).琼脂稀释法筛选试验：苯唑青霉素耐药培养基：含NaCLM-H琼脂（4%W/V；0.68mol/l）抗生素含量：6μg/ml苯唑青霉素或10μg/ml甲氧西林接种：直接菌落悬液约0.5麦氏比浊管，用拭子浸润菌悬液后，在平板表面点种或划线。培养条件：35℃空气培养时间：二十四小时，对于甲氧西林/苯唑青霉素耐药凝固酶阴性葡萄球菌，孵育48小时后再检测最可靠。结果：>1菌落=耐药推荐质控菌：金黄色葡萄球菌ATCC29213—敏感，金黄色葡萄球菌ATCC43300-耐药加强微生物监测提高抗感染治疗水平第52页当前治疗方案：MRS轻度感染：利福平、SMZ-TMP、环丙沙星；严重感染：万古霉素。对万古霉素耐药金黄色葡萄球菌称之为VRSA（Vancomycin-risistantS.aureus）只能用链阳霉素治疗。当前金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药尚不多见，国外学者将肠球菌耐万古霉素基因转移到金黄色葡萄球菌中已取得成功；日本、香港散在报道且仅万古霉素低度耐药（MIC8μg/ml），且国际上还未认可；6月美国从一40岁患有糖尿病、慢性肾脏衰竭患者导管中分离到对苯唑青霉素MIC>16μg/ml,对万古霉素MIC>128μg/ml耐万古霉素金黄色葡萄球菌，VRSA就在我们眼前。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第53页2.肠球菌检测：肠球菌是一个主要病原微生物，试验室应做高耐庆大霉素肠球菌检测。若高耐庆大霉素，则不能和作用细胞壁药品（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）协同使用。有条件试验室还应作VanA,VanB,VanC耐药基因监测。治疗标准：VanA：青霉素敏感（S），氨基糖苷类非高耐--青霉素+庆大霉素；青霉素耐药（R），氨基糖苷类非高耐--青霉素/头孢类+壁霉素+庆大霉素。VanB：氨基糖苷类非高耐株--壁霉素+庆大霉素。氨基糖苷类高耐株--壁霉素，新生霉素+氟喹诺酮类。多重耐药肠球菌当前尚无有效治疗方案。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第54页加强微生物监测提高抗感染治疗水平第55页（2）．肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药筛选试验（琼脂稀释法）筛选试验庆大霉素HLAR抗生素含量：500μg/ml接种：液体生长法或直接菌落法至0.5麦氏比浊管。琼脂-10ul0.5麦氏比浊管悬液点种在琼脂表面。孵育条件35℃空气孵育时间二十四小时结果：琼脂：>1菌落=耐药；肉汤：任何生长=耐药,耐药-不能和作用细胞壁药品协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素），敏感-能够和敏感作用于细胞壁药品协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药加强微生物监测提高抗感染治疗水平第56页筛选试验：

万古霉素耐药抗生素含量：6μg/ml接种：肉汤-推荐标准肉汤稀释法。液体生长法或直接菌落法至0.5麦氏比浊管。1-10μl0.5麦氏比浊管悬液点种在琼脂表面。孵育条件：35℃空气孵育时间：二十四小时结果：

>1菌落=耐药进行万古霉素MIC测定和动力试验产生色素来区分取得性耐药（VanA,VanB）和那些对万古霉素天然中水平耐药（VanC）如敦鸡肠球菌、铅肠球菌和黄肠球菌，它们通常在万古霉素筛选平板上生长。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药加强微生物监测提高抗感染治疗水平第57页3.超广谱β–内酰胺酶检测：超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯氏菌等革兰氏阴性杆菌在抗生素选择压力下产生。它是质粒介导对第一、二、三头孢菌素、氧亚氨基β-内酰胺抗生素耐药，有时尽管体外试验是敏感，是β-内酰胺酶基因Tem-1,Tem-2,SHV-1突变而来。ESBLs编码基因在质粒上，易在不一样菌株间播散，表现为多重耐药。当前将ESBLs分为TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型。共同特点是能被β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。

加强微生物监测提高抗感染治疗水平第58页(1)．纸片初筛：培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度:头孢泼肟10μg或头孢他啶30μg或头孢噻肟30μg或头孢曲松30μg（使用两个以上纸片做筛选试验可提升检出灵敏度）接种：按标准纸片扩散法孵育条件：35℃大气环境孵育时间：16-18小时结果：头孢泊肟抑菌环≤22mm，头孢他啶抑菌环≤22mm，氨曲南抑菌环≤27mm，头孢噻肟抑菌环≤27mm，头孢曲松抑菌环≤25mm，=可能产生ESBL。提议质控方法:大肠埃希菌ATCC25922（参考NCCLS抑菌标准）

肺炎克雷伯菌ATCC700603:头孢泼肟抑菌环9-16mm,头孢他啶抑菌环10-18mm,氨曲南抑菌环9-17mm,头孢噻肟抑菌环17-25mm,头孢曲松抑菌环16-24mm。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第59页(2)纸片确证试验：培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度：头孢噻肟30μg、头孢噻肟/棒酸30μg/10μg和头孢他啶/棒酸30μg/10μg接种：按标准纸片扩散法孵育条件：35℃大气环境孵育时间：16-18小时结果：混合棒酸药品纸片抑菌圈直径比无棒酸药品纸片直径大5mm以上=ESBL提议质控方法：大肠埃希菌ATCC25922单独药品和混合棒酸药品两种纸片抑菌环直径相差小于2mm。肺炎克雷伯菌ATCC700603：头孢他啶单独药品和混合棒酸药品纸片抑菌环较头孢他啶单独药品纸片抑菌环直径增大5mm以上，头孢噻肟单独药品和混合棒酸药品纸片抑菌环较头孢噻肟单独药品纸片抑菌环直径增大3mm以上。加强微生物监测提高抗感染治疗水平第60页加强微生物监测提高抗感染治疗水平第61页(3)液体稀释法初筛:培养基：CAMHB（调整好阳离子M-H肉汤）抗生素浓度：头孢泼肟4μg/ml或头孢他啶1μg/ml或氨曲南1μg/ml或头孢噻肟1μg/ml或头孢曲松1μg/ml（使用1种以上药品做筛选试验可提升检出灵敏度）接种：按标准肉汤稀释法要求进行孵育条件：35℃；空气孵育时间：16-18小时结果判读：生长=可疑有ESBLS产生（即头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松MIC≥2μg/ml；头孢泼肟MIC≥8μg/ml

）质控提议：大肠埃希氏菌ATCC25922不长肺炎克雷伯氏菌ATCC700603，头孢泼肟MIC≥8μg/ml加强微生物监测提高抗感染治疗水平第62页(4)液体稀释法确证:

培养基: CAMHB药品浓度: 头孢他啶0.25-128μg/ml,头孢他啶/克拉维酸0.25/4-128/4μ