分子诊疗室项目介绍专家讲座

分子诊疗室项目介绍1分子诊疗室项目介绍第1页内容1.HBV-DNA荧光定量PCR2.流式基本应用3.染色体核型分析2分子诊疗室项目介绍第2页HBVDNA荧光定量PCR3分子诊疗室项目介绍第3页 PCR技术介绍1985年美国PE-cetus企业人类遗传研究室mullis等人创造了含有划时代意义PCR技术，从而使人们梦寐以求体外扩增核酸片段愿望成为现实。1988年PE-cetus企业推出了第一台PCR热循环仪，从而使PCR技术自动化成为现实。Mullis出因其卓越贡献与寡核苷酸基因定点诱变创造者Michael分享了1993年诺贝尔化学奖。伴随PCR技术日臻成熟1995年出现荧光基因探针杂交定量PCR方法4分子诊疗室项目介绍第4页PCR基本原理类似DNA体内复制，以单链DNA为模板，利用DNA聚合酶依赖于模板特征，在附加一对寡核苷酸引物之间催化合成互补链过程。5分子诊疗室项目介绍第5页DNA合成必备要素DNAPolymerasedNTPssingle-strandedtemplateprimer6分子诊疗室项目介绍第6页定量PCR概念以外参或内参为标准，经过对PCR终产物分析或PCR过程监测，对PCR起始模板量定量7分子诊疗室项目介绍第7页常规PCR与定量PCR比较8分子诊疗室项目介绍第8页实时荧光定量PCR原理指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测PCR进程，最终经过标准曲线对未知模板进行定量分析。Ct（cyclethreshold)值定义：每个反应管荧光信号抵达设定阈值时所经历循环数。荧光阈值（threshold)缺省设置是3-15个循环荧光信号标准偏差10倍，即：threshold=10×SDcycle0-159分子诊疗室项目介绍第9页Ct值与起始模板关系每个模板Ct值与该模板起始拷贝数对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数标准品作出标准曲线，只要取得未知样品Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。10分子诊疗室项目介绍第10页荧光定量标准曲线

标准曲线未知标本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target3811分子诊疗室项目介绍第11页荧光检测模式（1）SYBRGreenI染料（2）水解探针（Taqman）

（3）杂交探针（HybridizationProbes）（4）分子信标（molecularbeacon)发夹引物（sunriseprimer)蝎状引物（scorpionprimer)复合探针（complexprobes)12分子诊疗室项目介绍第12页探针5'端标识一个荧光基团，3'标识另一个荧光基团。5'端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近3’端荧光淬灭基团（FRET），正常情况下检测不到该探针5'端荧光基团发出荧光信号。Taqman探针原理13分子诊疗室项目介绍第13页当溶液中模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物介导下，Taq酶沿模板向前合成子链，当延伸至探针结合处，发生链置换；Taqman探针原理14分子诊疗室项目介绍第14页Taqman探针原理Taq酶5‘—3’外切酶活性将探针5‘端连接荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团屏蔽，发出荧光，荧光信号与PCR产物数量成百分比。所以依据PCR反应液荧光强度即可计算出初始模板数量。15分子诊疗室项目介绍第15页定量PCR在乙肝检测中意义1.判断疾病严重程度和传染性2.PCR结果与血清免疫学结果综合评价3.观察抗病毒药品疗效，指导药品用量4.献血员窗口期病毒核酸筛查及早期诊疗5.预测病情、判断预后6.器官移植、母婴垂直传输16分子诊疗室项目介绍第16页17分子诊疗室项目介绍第17页标本留取及检测步骤标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本防止溶血和脂血。检测步骤：1.反应液配制2.核酸提取3.核酸扩增结果分析：采取样点拟正当，由标准曲线得到病毒拷贝或IU/ML。18分子诊疗室项目介绍第18页1.分区操作：PCR含有超敏感性，所以在检测过程中应分区操作，即分为试剂准备区，样品处理区，PCR扩增区。2.试验前试验室应使用紫外消毒最少30分钟。3.操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时防止飞溅。注意事项19分子诊疗室项目介绍第19页4.天天试验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，试验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。5.全部试剂试验前充分融化，防止重复冻融。6.每次PCR反应均应设置阴阳性对照。注意事项20分子诊疗室项目介绍第20页流式基本应用

21分子诊疗室项目介绍第21页流式细胞术概念流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一个能够快速、准确、客观，而且能够同时检测快速直线流动状态中单个微粒（通常是细胞）多项特征，并加以定量技术，同时能够对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究微粒特征包含各种物理及生物学特征22分子诊疗室项目介绍第22页流式细胞仪检测范围细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面面积核浆百分比DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功效细胞表面/胞浆/核特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体23分子诊疗室项目介绍第23页散射光信号RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

细胞相对大小及其表面积

侧向角散射光（SSC,SideScatter）

细胞颗粒度及细胞内细胞器相对复杂性24分子诊疗室项目介绍第24页外周全血细胞散射光双参数点图

（红细胞溶解后）25分子诊疗室项目介绍第25页荧光信号使用荧光标识单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号强弱，反应了细胞抗原表示含量26分子诊疗室项目介绍第26页数据分析数据显示: 直方图(Histogram) 二维点图(DotPlot) 等高线图(ContourPlot) 密度图(Density) 三维图（3DPlot）27分子诊疗室项目介绍第27页流式临床应用淋巴细胞亚群分析白血病和淋巴瘤免疫分型肿瘤细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植免疫状态监测干细胞计数阵发性血红蛋白尿HLA-B27检验血小板功效及相关疾病HIV免疫分型，CD4绝对计数28分子诊疗室项目介绍第28页淋巴细胞亚群分析使用经荧光素标识特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上各种白细胞分化抗原（CD分子）表示，能够将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析各淋巴细胞亚群百分含量淋巴细胞亚群绝对计数，进行定量分析29分子诊疗室项目介绍第29页依据功效，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫相关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫相关总T和总B能够用来判断一些免疫缺点和本身免疫性疾病NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功效，能够介导对一些肿瘤细胞和病毒感染细胞细胞毒性作用。30分子诊疗室项目介绍第30页依据CD4、CD8表示，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+），即Th/TiT抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）,即Ts/TcTh/Ts比值可用于评价本身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺点病人免疫状态31分子诊疗室项目介绍第31页临床意义诊疗原发性免疫缺点病（如先天性无r球蛋白血症）或继发性免疫缺点病（如AIDS）造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B）Th/Ts

：机体免疫功效亢进：本身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）Th/Ts

：机体免疫功效低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等32分子诊疗室项目介绍第32页临床意义移植后动态免疫监测：急排临床症状出现前1-5天，活化T和Th/Ts连续，>1.2预示急排；Th/Ts连续表明可能感染，比值<1.08，可能性大，<0.2应停用免疫抑制剂；实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察治疗前常伴T

、Th/Ts，放/化疗有效可恢复；淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常很好；探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）33分子诊疗室项目介绍第33页淋巴细胞亚群双色分析34分子诊疗室项目介绍第34页先天性无r球蛋白血症35分子诊疗室项目介绍第35页淋巴细胞亚群双色分析36分子诊疗室项目介绍第36页HLA-B27☆HLA-B27是MHCI类抗原，在有核细胞上广泛表示HLA-B27表示与强直性脊柱炎高度相关，超出90%强直性脊柱炎患者HLA-B27阳性。其它，如Reiters综和症阳性率70-90%，银屑病性关节炎阳性率50-60%，葡萄膜炎阳性率40-50%☆检测采取全血，无需分离淋巴细胞，操作简单，能够快速、灵敏、准确地分析HLA-B27。☆结果汇报检测平均荧光强度，依据界值判定，得到阴性/阳性结果。试验灵敏度为100%，特异性为97.5%。37分子诊疗室项目介绍第37页流式细胞仪应用（血液）白血病和淋巴瘤免疫分型造血干细胞计数阵发性血红蛋白尿（PNH）诊疗网织红细胞计数血小板分析血小板膜糖蛋白分子表示血小板活化网织血小板分析38分子诊疗室项目介绍第38页流式细胞仪应用（肿瘤）细胞周期和倍体分析

肿瘤相关基因表示研究抗肿瘤药品作用机制研究放疗/化疗疗效研究

多药耐药基因研究细胞凋亡分析凋亡细胞分析凋亡相关蛋白分析39分子诊疗室项目介绍第39页流式标本留取

紫色盖试管，EDTA抗凝血或骨髓1-2ml。不能有凝块。单细胞悬液细胞数不少于106个。40分子诊疗室项目介绍第40页

染色体核型分析41分子诊疗室项目介绍第41页基本概念染色体核型：指一个物种所特有染色体数目和每一条染色体形态特征。------人类体细胞中共有23对染色体，22对常染色体，一对性染色体。核型分析：将待测细胞核型进行染色体数目、形态特征分析过程称核型分析。如正常女性核型：46,XX正常男性核型：46，XY。核型模式图：是指将一个染色体组全部染色体逐一按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来图像。42分子诊疗室项目介绍第42页染色体模式图43分子诊疗室项目介绍第43页人类23对染色体44分子诊疗室项目介绍第44页45分子诊疗室项目介绍第45页染色体编号(人X染色体)记述一特定带时，需要写明4个内容：染色体号，长短臂，区号序和带号序。这些内容按次序写，不用间隔或加标点。假如某一带被再细分，在原带号数后加一小数点，编号标准仍按从着丝粒往臂端序贯编号。如1p31.2代表一号染色体短臂3区1带第2亚带46分子诊疗室项目介绍第46页染色体标本常规制备

方法：中期染色体G带显色原理：采取秋水仙素处理培养细胞，使细胞停留在分裂中期，再用低渗液处理细胞，使细胞胀大，以进行染色体制片。G-带是标本片经过预处理后，用Giemsa染色显示带纹。47分子诊疗室项目介绍第47页操作步骤

细胞培养：

细胞培养液5mL（含植物凝血素），加0.3mL肝素抗凝全血37℃培养箱静置培养68～72小时。收获细胞：

终止培养前1～1.5小时加入秋水仙素。

制片：低渗-预固定-固定-滴片-干燥老化

G-显带，图像分析：胰酶消化，

Giemsa染色，采集图像，分析20-30个中期分裂相48分子诊疗室项目介绍第48页核型描述首先列出染色体总数，然后是性染色体组成，接着列出异常染色体数目或形态。以下统一命名符号：A-G染色体组名称1-22染色体编号X,Y性染色体del缺失der结构重排染色体dup重复inv倒位t易位+/-在染色体符号前表示染色体增加或降低，在染色体符号后表示染色体多出或缺乏一部分49分子诊疗室项目介绍第49页检验适应症及意义生殖功效障碍

在不孕症、多发性流产和畸胎等有生殖功效障碍妇夫中最少有7%~10%是染色体异常携带者。常见有染色体结构异常如平衡易位和倒位以及数量异常如因为女性少一条X染色体造成45，XO，或多一条Y染色体造成47，XXY。平衡易位和倒位因为无基因丢失，携带者本身常并不发病，却可因其生殖细胞染色体异常而造成不孕症、流产和畸胎等生殖功效障碍。性染色体数目异常除可造成不孕外，还常出现第二性征异常。

50分子诊疗室项目介绍第50页检验适应症及意义第二性征异常者