分子诊断的其它应用专家讲座

全国高等医药院校教材-分子诊疗学第十七章

分子诊疗其它应用

生化与分子生物学学科

.4

分子诊断的其它应用第1页全国高等医药院校教材-分子诊疗学第一节

分子诊疗在移植配型中应用——HLA分子生物学分型第二节

分子诊疗在法医学判定中应用第三节

单核苷酸多态性分析分子诊断的其它应用第2页第一节

分子诊疗在移植配型中

应用—HLA分子生物学分型

一、HLA遗传学基础Humanleucocyteantigen人类白血病抗原全国高等医药院校教材-分子诊疗学分子诊断的其它应用第3页一、HLA与器官移植基本概念

①组织相容性（histocompatibility）器官或组织移植时供者与受者相互接收程度，不相容就会出现排斥反应（rejection），诱导排斥反应抗原称为组织相容性抗原，也称为移植抗原。分子诊断的其它应用第4页②主要组织相容性抗原（MHA）主要组织相容性抗原Majorhistocompatibilityantigen次要组织相容性抗原人类白细胞抗原

HLA

Humanleukocyteantigen其中与移植排斥相关主要为HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗原。

分子诊断的其它应用第5页③主要组织相容性复合体（MHC）编码MHA(在人为HLA)基因是一组呈高度多态性基因群，集中分布于染色体上特定区域，称为主要组织相容性复合体（majorhistocompatibilitycomplex，MHC），MHC编码产物称为MHC分子。分子诊断的其它应用第6页抗原

免疫系统抗原肽－MHCⅡ/Ⅰ分子复合物

免疫应答CD4+/CD8+T细胞（细胞免疫、体液免疫）

抗原性异物排除◆MHC分子为T细胞分化发育所必需

◆MHC分子为免疫应答开启和调整所必需分子诊断的其它应用第7页分子诊断的其它应用第8页(一)MHC/HLA基因组成

人类MHC又称为HLA基因复合体，位于第6对染色体短臂6p21.3上，约4000kb。HLA基因有七大类：即A，B，C，D，DR，DQ，DP。这七大类座位内又有不一样位点。依据编码分子功效和分布不一样，可将整个复合体基因分成三类：Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因。全国高等医药院校教材-分子诊疗学分子诊断的其它应用第9页分子诊断的其它应用第10页分子诊断的其它应用第11页分子诊断的其它应用第12页HLA基因分类

分类

基因座位

Ⅰ类基因

HLA-A-B-C

HLA-E-F-G-H-XⅡ类基因

HLA-DP-DQ-DR

HLA-DN-DO-DMⅢ类基因

位于Ⅰ和Ⅱ类基因之间主

要编码一些补体和炎症因

子（如：C4A，

C4B，C2，Bf等补体组分）分子诊断的其它应用第13页HLA抗原分布HLA-I类抗原分布于有核细胞表面；HLA-II类抗原主要表示在活化Mφ、B细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞，血管内皮细胞及活化T细胞表面。HLA-III主要是一些补体成份：如C2、C4、Bf等。分子诊断的其它应用第14页MHCclassIproteinsformafunctionalreceptoronmostnucleatedcellsofthebody.分子诊断的其它应用第15页Thereare3majorand2minorMHCclassIIproteinsencodedbytheHLA.ThegenesoftheclassIIcombinetoformheterodimeric(αβ)proteinreceptorsthataretypicallyexpressedonthesurfaceofantigenpresentingcells.分子诊断的其它应用第16页分子诊断的其它应用第17页（二）HLA遗传特点1．单倍型遗传

haplotype因为一条染色体上HLA各位点距离非常近，极少发生同源染色体之间交换，所以亲代HLA以单倍型为单位将遗传信息传给子代。

ABabGHghABGHABghababGHgh（1）（2）（3）（4）全国高等医药院校教材-分子诊疗学分子诊断的其它应用第18页分子诊断的其它应用第19页分子诊断的其它应用第20页2．共显性遗传

共显性（co-dominance）是指某位点等位基因均能同等表示，二者编码产物都可在细胞表面检测到。多数个体HLA位点都是杂合子，但当父亲和母亲在某位点上含有相同等位基因时，其子代这个位点就成为纯合子。分子诊断的其它应用第21页CodominantexpressionofHLAgenes分子诊断的其它应用第22页分子诊断的其它应用第23页3．连锁不平衡

理论上，一个HLA位点等位基因与另一个或几个位点等位基因在某一单倍型出现频率应等于各自频率乘积。然而实际情况是，在不一样地域或不一样人群，一些基因相伴出现频率尤其高，这种现象称为连锁不平衡。已经发觉一些疾病发生与HLA复合体中一些特定等位基因亲密相关。分子诊断的其它应用第24页二、分子生物学分型法

1.RFLP与PCR-RFLP分型法

将目标基因片段PCR扩增后，利用各种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，不一样基因序列会产生不一样酶切产物，从而产生不一样电泳图谱。它以简单、敏感、准确，无需同位素等优点成为当前较惯用HLA基因分型技术之一，不过无法分辨杂合子，且只能区分有限多态性。全国高等医药院校教材-分子诊疗学分子诊断的其它应用第25页2.PCR-SSP分型法[等位基因特异性PCR（ASPCR）]设计出一整套等位基因组特异性引物（sequencespecificprimer,SSP），借助PCR技术取得HLA型特异扩增产物，可经过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了试验步骤。优点是简单易行,分辨率可从低到高,成本低。缺点是不易自动化;不能检测新等位基因，试剂盒需不停升级。分子诊断的其它应用第26页3.PCR-SSCP分型法

假如二个HLA等位基因存在点突变，经PCR扩增后进行聚丙烯酰凝胶电泳，因其序列差异形成不一样空间构象，则电泳迁移率也不一样，如此可将它们区分开。PCR-SSCP作为PCR-SSO补充，有利于新HLA等位基因或突变体发觉，在区分纯合子和杂合子基因方面有其独到之处。分子诊断的其它应用第27页4.SBT分型法

SBT分型法——基于序列HLA分型法(Sequence-BasedHLATyping)，是通过对扩增后HLA基因片段进行核酸序列测定，从而判断HLA型别方法。以上各个方法都存在一些缺点，如能配合使用，则能大大提升分型能力。分子诊断的其它应用第28页5.基因芯片技术我国生物芯片技术取得重大突破！由军事医学科学院放射与辐射医学研究所王升启研究员领导课题组，与深圳益生堂生物企业有限企业联合研制HLA-DRB1分型基因芯片试剂盒，于年9月取得了由国家食品药品监督管理局（SFDA）颁发新药证书和生产文号。这是在国家自然科学基金重点项目和863计划资助下，基因芯片技术应用又一里程碑式重大结果。分子诊断的其它应用第29页分子诊断的其它应用第30页

移植配型(又称为HLA配型/组织配型):指在器官移植中检验供受者之间移植抗原（HLA）是否相配一系列办法。当前主要检测是ABO抗原系统和HLA抗原系统。

HLA抗原系统主要进行HLA-A、HLA-B和HLA--DR三对位点配型，只有两个个体HLA配型完全相同才能进行造血干细胞移植，不然会发生移植排斥反应。全国高等医药院校教材-分子诊疗学三、HLA配型在器官移植中应用分子诊断的其它应用第31页理论上说，同胞弟兄姐妹中有1/4机会HLA配型完全相合；儿女与父母之间只有二分之一HLA抗原相同，医学上叫做半相合，通常不能相互移植。所以骨髓移植主要在同胞弟兄姐妹之间进行。常见HLA分型，在300－500人就能够找到相同者，少见HLA分型可能是万分之一机率，而罕见就要到几万甚至几十万人群中寻找。分子诊断的其它应用第32页分子诊断的其它应用第33页

HLA抗原系统可经过血清学方法、细胞学方法、分子生物学方法来检测。

血清学分型借助是微量淋巴细胞毒试验或称补体依赖细胞毒试验。取已知HLA抗血清加入待测外周血淋巴细胞，作用后加入兔补体，充分作用后加入染料，着染细胞为死亡细胞，依据特异性抗体介导补体系统对靶细胞溶解原理，待检淋巴细胞表面含有已知抗血清所针正确抗原。分子诊断的其它应用第34页细胞学分型技术指是经过纯合分型细胞及预致敏淋巴细胞试验对HLA分型。二种方法基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原决定簇后发生增殖反应。因为分型细胞起源困难以及操作繁琐，细胞学分型技术正逐步被淘汰。流式细胞术取之分子生物学分型法利用PCR技术将少许目标DNA大量扩增，然后再进行产物判定方法，特点是灵敏度高，应用范围广等特点。分子诊断的其它应用第35页寻求与受者MHC相配供者组织或器官

1)

ABO血型相容试验：2)

淋巴细胞毒交叉试验（MLR）： +不宜移植受者血清+供者淋巴细胞-可行3)

HLA定型或配型试验非家庭配型：表现型相同

MHCII(HLA-DR)配合优于MHCI类

HLA-DR和HLA-DQ间连锁不平衡分子诊断的其它应用第36页分子诊断的其它应用第37页第二节

分子诊疗

在法医学判定中应用提要：一、PCR技术在法医判定中应用二、DNA指纹图谱技术三、STR位点分析四、DNA数据库建立与

DNA数据交换五、性别判定与Y基因检测全国高等医药院校教材-分子诊疗学分子诊断的其它应用第38页分子生物学优点：

（1）检材广泛，稳定性高（2）方法灵敏（3）高概率认定全国高等医药院校教材-分子诊疗学分子诊断的其它应用第39页一、PCR技术在法医判定中应用亲子判定：指在对父母和儿女之间亲生关系（或称为生物学关系）有所怀疑时，进行遗传关系方面检验，方便确定亲子关系是否存在，又称为亲权判定。个体识别：又称个人同一认定。即使二者判定目标不一样，但使用方法是一样。全国高等医药院校教材-分子诊疗学分子诊断的其它应用第40页DNA提取

假如相匹配，将HLA分型与群体数据库进行比较

发出案例汇报，并给出随机匹配概率

DNA定量

多个STR标识PCR扩增

待检样本HLA分型与其它结果比较

PCR产物分离与判定

确定HLA分型

图15-1生物物证分析中HLA基因分型判定流程图全国高等医药院校教材-分子诊疗学分子诊断的其它应用第41页二、DNA指纹图谱技术一个DNA指纹能同时检测十几个甚至几十个位点变异，反应基因组信息非常丰富DNA指纹图谱由多个高变位点上等位基因形成，含有更高特异性严格遵照孟德尔遗传规律，遗传性简单稳定DNA指纹图谱含有体细胞稳定性全国高等医药院校教材-分子诊疗学分子诊断的其它应用第42页三、STR位点分析STRs是首选群体遗传学和法医学研究遗传标志物美国联邦数据库（CombinedDNAIndexSystem,CODIS）公布13个STR位点：D3S1358、VWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、THO1、TPOX、CSF1PO

AMEL（性别确定基因）

全国高等医药院校教材-分子诊疗学分子诊断的其它应用第43页分子诊断的其它应用第44页分子诊断的其它应用第45页分子诊断的其它应用第46页分子诊断的其它应用第47页分子诊断的其它应用第48页分子诊断的其它应用第49页分子诊断的其它应用第50页AMEL（性别确定基因）Thegeneforamelogenin（牙釉蛋白）canbeusedinsexdeterminationofsamplesfromunknownhumanoriginthroughthePolymeraseChainReaction(PCR).Usingprimersspecificforintron1ofthegene,thegenesequencefortheintroncanbeamplified.TheXchromosomegene,AMELX,givesrisetoa106bpamplificationproduct(amplicon)andtheYchromosomegene,AMELY,a112bpamplicon.Hence,theAMELXcontainsa6bpdeletionintheintron1.分子诊断的其它应用第51页分子诊断的其它应用第52页优势CODIS已经广泛地应用于法医DNA分析STR等位