瑞沃德-光纤记录实验手册 -嗅觉研究应用白皮书

为生命品质的提升贡献智慧和力量,成为世界级领先企业。 4 4 6 82.嗅觉行为训练原理u 2.1.2延迟非匹配样本任务DNMS(DelayedNonMatchtosampletask) 2.1.3延迟配对偶联任务DPA(DelayedpairedAssociationtask) .使用光纤记录技术应用至嗅觉研究isau实验设备和材料 4.2.2器具消毒、仪器检查 400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司 4,3.5埋植陶瓷插针及固定嗅觉头杆 aa光纤记录与嗅觉行为实验 4,4.2光纤记录结合嗅觉行为实验 5.5耗材参数搭配 2.嗅觉研究数据34 深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l 1.3.1超100小时稳定采集 1.4.1满足皮瓦级微弱信号检测需求(轴突i胶质细胞) 2.嗅觉行为训练系统主要功能特点44 深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l 3.1外侧内嗅皮层直接编码奖赏关联性学习 记忆下丘脑环路调控海马神经发生促进记忆提取对抗焦虑样行为 s.嗅觉行为训练系统应用案例so5.1延迟期间的内侧前额叶活动有助于学习工作记忆任务 1.3光纤及陶瓷插针的的NA值是什么意思?代表什么意义? 1.5融合光纤是什么?和一分二光纤的区别? 2.嗅觉训练系统常见问题及解析58 2.2嗅觉记忆认知行为训练实验会用到多少个 深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l 2.4嗅觉行为训练能同步进行电生理记录实验吗? 2.5嗅觉行为训练过程中产生的实验气味扩散到实验室是否构成危害? 400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司第一章初学者导航本章将介绍光纤记录发展历史和嗅觉研究的基本知识,如果你是刚开始学习光纤记录技术并应用到嗅觉研究上,以下的概要内容将对你非常有帮助。1.光纤记录发展历史光学来测量荧光分子在大脑中发出的光信号。那么从这个原理中,我们能够明白,实现这个实验需要能够在大脑表达荧光的探针工具,同时需要一套可以传输荧光,检测荧光的设备。目前最常用的荧光工具分为钙信号探针,神经递质信号探针,电压敏感探针等。因为实验应用的动物模型种类很多,同时我们还需要研究特定脑区甚至特定种类细胞,所以基因编辑技术已经广泛应用在探针的开发上。2014年,斯坦福大学的karlDeisseroth教授实验室在发表的文章中首次命名了末梢钙活动的同时追踪,结合光遗传技术,阐明了腹侧背盖区-伏隔核的神经投射在编码和预测社交行为中的作用。基于遗传编码钙指示剂的发展,实验人员可以实现细胞类型特异性的标记,监测小鼠在完成复杂行为任务过程中一群特定类型细胞的平均活动。这种技术的出现对于编码社交行为、学习记忆和恐惧等行为以及病理回路水平神经信号的探测具有里程碑式的意义。近年来,随着可遗传编码荧光指示剂的不断更新迭代和神经递质探针的开发,应用光纤记录技术来检测清醒自由活动动物神经系统的钙信号及神经递质,以反应神经元活动和神经递质的调节过程,已成功发表近千篇文章,并成为发育、神经可塑性和神经退行性疾病等研究的重要技术手段。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司2.嗅觉研究基本知识大脑持续从周围环境接收大量的感官刺激,例如气味、光线、声音、碰触等。在生命体正常状态下,大脑灵活地调整各种信号通路,高效处理感官刺激信息。嗅觉是基于前期的解剖和功能研究,已知嗅觉传导包括3个部分:①嗅裂的嗅觉神经元接受嗅刺激,经嗅神经到嗅球;②嗅球换元经嗅束到达初级嗅觉皮层,包括前嗅核、梨状皮层、杏仁核及内嗅区等;③传递至次级嗅觉皮层,包括海马体、额眶皮质、岛叶及等。值得一提的是,嗅觉、味觉和三叉神经功能虽是3种截然不同的方式,但在日常生活中,他们往往是伴随激活的。嗅觉作为关键的感觉之一,就感知能力来说极为复杂,人类可以辨识约一万种以上的不同气味,许多生物虽然沒有很好的视力,却有相当敏锐的嗅觉,嗅觉的重要性逐渐被人们认识。嗅觉感受器的类型是所有感觉系统中最多的,小鼠有着约1000种编码嗅觉感受器的基因,占了全基因组的3%。而人类功能性的嗅觉感受器编码基因大约为400个,还有约600个假基因。气味多是一系列化合物的复杂成分构成,所以当我们感受一种气味时,其实是不同的嗅觉感受器产生不同强度的响应,综合感受处理嗅觉信息。因此,嗅觉信息整合处理的嗅觉环路机制本身,就是非常有价值的科学问题。另外,大量临床研究发现,许多脑部病变的发生都伴随着嗅觉障碍,例如头部外伤、丘脑或前额叶皮质病变、颅内压增高等病变,另外在阿尔茨海默症、路易体痴呆、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑性共济失调等神经系统疾病中也障碍。在动物实验研究中,嗅觉作为驱动认知行为的重要感觉模式,在嗅觉辨别、学习记忆、决策、冲动等认知行为中发挥重要作用,基于嗅觉刺激的行为学实验在相关研究中应用广泛,推动了认知及神经系统疾病机制的研究进展。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司嗅觉系统示意图参考文献:2.LUO,L.(2020).principlesofNeurobiology(2nded.).Garlandscience,3.DUW,chenF.[Applicationresearchanddezazhi.2022Jun;36(6):482-486.chinese.深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司第二章工作原理及数据采集分析本章节将解释光纤记录及嗅觉行为实验的工作原理、优点,并展示相关的实验操作步骤、实验注意事项及数据分析等内容。3.光纤记录的优点4.使用光纤记录技术应用至嗅觉研究5.光纤记录实验注意事项7.嗅觉研究数据8.光纤记录数据分析1.光纤记录工作原理1.1基本原理人类大脑有大约900亿个神经元,这些神经元通过突触相互连接,形成复杂的神经网络,从而产生各种复杂的功能。大脑可以合成和释放数百种神经递质,神经信号通过突触释放的神经递质在神经元之间传递。当神经兴奋传递到突触末端时,会刺激突触上的钙通道打开,促进钙离子的流入,细胞内钙离子的浓度瞬时上升,驱动突触小泡将神经递质释放到突触间隙,并与突触后膜上的受体结合,将神经递质信号传递给下一个神经元,从而逐步传递信息。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司以钙离子的检测为例,在神经系统中,静息状态下神经元的细胞内钙浓度约为50-100nM,但当神经元兴奋时,细胞内钙离子浓度会增加10-100倍,因此我们可以通过注射钙离子基因编码指示剂(calciumindicator,如GcaMPSRcaMPS等)来标记钙离子。常见的基因编码钙离子指示剂来自于绿色荧光蛋白(GFP等)及其变异体(例如循环排列GFP、YFP、CFP、RFP等)的荧光蛋白质,可与钙调蛋白(caM)和肌球蛋白轻链激酶M13域结合。当神经活动增强时,钙通道打开,大量构重排,从而增强绿色荧光信号。光纤记录系统的技术原理是借助钙浓度的变化与神经元活动之间的严格对应关系,使用特殊的荧光指示剂或荧光探针,将神经元中钙离子的浓度通过荧光强度表达,并被光纤记录系统捕获,从而达到检测神经元活动的目因此,我们可以通过检测钙信号的变化来表征神经元的活动,进而研究神经元活动与动物行为之间的相关性,探索复杂行为背后的调节机制。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司光纤记录检测神经递质信号的原理与上述相同,把对结构变化敏感的荧光蛋白 变,并增强荧光信号,结合现有的成像技术,实时监测神经递质浓度的动态变化。1.2光纤记录常用的荧光指示剂通过病毒注射、转染等技术手段,可以将上述可遗传编码的指示剂或探针表达在细胞或小鼠脑部。现在使用较广泛的基因编码钙离子指示剂有:GcaMP、pericams、cameleons、TN-XXL和Twitch等,其中GcaMP6GcaMP7由于有着超强的敏感度,现在被广泛应用于活体钙成像研究。以下是常见基因编码钙离子指深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司GcaMP6GcaMP6SGcaMP6mGcaMP6fneuritisornervefibHighcontrast,suitablefobeusedwithGcaMPjRcaMplbAxon-GcaMPAxon-GcaMPMarktheaxon(胆囊收缩素),VIP(血管活性常肽),ecB(内源性大麻素)等。因为钙信号以及神经递质的信号变化周期相对较慢(ms),如果我们想要记录膜电位的快速信号,就需要使用电压敏感探针(GEVI)等相关工具。膜电位的变化是突触电位和动作电位的直接标志。在某些情况下,深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司在了解这些荧光指示剂之后,我们需要清楚该如何将指示剂表达到动物体内。常见的办法有病毒转染,动物杂交等。以脑立体定位注射为例,整体实验流程包括:①选择合适的病毒工具(病毒包含着指示剂的编码信息)注射到特定位置;②在注射位点埋植光纤,用于传送激发光和收集发射光,并固定嗅觉头杆,用于将小鼠固定于嗅觉行为训练系统的固定器上;③等待2-3周时间,病毒表达后即可结合嗅觉训练系统1.3荧光信号的激发当动物准备完成,需要选择一款合适的系统用于收集分析荧光信号。光纤记录系统基本的组成包括激发光源,滤光片,二色像镜,探测器,以及能够传输激发光和发射光的光纤耗材等。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司选择不同种类的配件导致了系统的核心功能有所差示剂的激发波长范围进行选择,Gcamp的激发波长集中在450nm-480nm之间,而Rcamp激发波长集中在550nm-600nm之间。同时需要选择合适的激发功率,例如GcaMP的激发功率在20W~50uW之间较为合适,如果功率过高,则容易导550nm之间,而Rcamp发射波长集中在570nm-630nm之间。不同荧光蛋白激发及发射波长范围PMT光电倍增管灵敏度高,适合用于极弱信号的检测,但是仅可用于单通道实验;CCD可用于多通道记录,但是成像速度较慢;CMOS具有更好的性价比,可用于多通深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司道记录,同时图像处理速度很快。多通道实验记录可以使用多分支光纤,通过一个系统就可以记录多个脑区或者多只动物的信号变化,极大拓展研究场景及提高实验效l光纤耗材等需要选择带有黑色保护层,且自发荧光较低的材质,可以更好的避免环境光以及自发荧光对于信号的干扰。光纤记录实验的耗材选择可以参考以下文对于不同颜色的荧光指示剂,探测器通过软件控制激发光以及探测器的特定开放时间,或者选择增加探测器,将两种信号进行独立采集,以区分两种不同的信号。从上图中可看出,410nmLED470nmLED560nmLED激发光源在特定帧率下(可通过软件设置)交替输出。而两个探测器,cameral只在410&470nmLED输出的时候进行同步采集信号(对应收集绿色荧光信号),camera2只在560nmLED输出的时候进行同步采集信号(对应收集红色荧光信号)。在瑞沃德光纤记录系统中,采用了双检测器、分时序采集的设计。虽然较多的文扰。但是单探测器使用的是双波段滤光片(可对绿色和红色同时通过),有可能会有深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司非常少的串扰影响。这是因为470nmLED存在一定可能性激发红色荧光探针,从而让红色荧光增强,造成串扰。钙离子指示剂在405-420nm波长光激发时,其荧光强度随细胞内ca2+浓度变化维持一个恒定的状态。因此,可以从一定程度上认为410nm激发所对应的荧光信中,可以针对性将背景信号去除,从而获取真实信号。2.嗅觉行为训练原理嗅觉行为训练原理是基于嗅觉刺激关联饮水奖励反馈,建立认知学习范式,通过奖励强化小鼠学习识别不同气味,快速帮助用户开展基于嗅觉刺激的认知评估实验。可兼容光遗传、光纤记录、电生理等系统拓展实验场景,推动课题进展。也可专用于稳定传递实验气味,结合下游场景进行实验。2.1经典实验范式400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司为生命品质的提升贡献智慧和力量,成为世界级领先企业。嘴获得饮水奖励;闻到气味B时,舔珉水嘴不会有饮水奖励,且要求小鼠拒绝舔珉水2.1.2延迟非匹配样本任务DNMS在该任务中,训练小鼠根据气味的不匹配关系做出正确响应以获得饮水奖励。给小鼠先后闻两个气味,若两个气味不同,则舔珉水嘴获得饮水奖励;反之,若为同种气味,舔珉水嘴不会有饮水奖励,且要求小鼠拒绝舔珉水嘴。2.1.3延迟配对偶联任务DPA(DelayedpairedAssoc在该任务中,训练小鼠根据气味的配对偶联关系做出正确响应以获得饮水奖励。给小鼠先后闻两种不同的气味,固定气味组合是有奖励试验组(例如气味A&D,气味B&C),小鼠舔珉水嘴获得饮水奖励;另外气味组合是无奖励试验组(例如气味A&C,气味B&D),小鼠舔珉水嘴不会有饮水奖励,且要求小鼠拒绝舔珉水嘴。2.2常用实验气味酯类甲酸丙酯甲酸丁酯乙酸乙酯乙酸丙酯乙酸异戊酯异戊烯醇1-丁醇1-戊醇叔戊醇正己醇酮类2-己酮环己酮2-庚酮苯类醛类苯乙醛其他柠檬醛丁香油醋酸选择一款合适的系统将有助于你的实验。如果你想深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966s-9516lrwd@IW为生命品质的提升贡献智慧和力量,成为世界级领先企业。练系统有更多的了解,欢迎联系我们!3.光纤记录的优点研究清醒和自由活动动物的神经系统是当代神经科学研究的一个关键检测与神经元活动相关的钙信号,我们能够更好地理解复杂的神经回路。近年来,包括双光子显微镜、单光子显微镜和光纤记录在内的技术发展使我们能够实时检测动物过去,大多数体内钙成像都是在双光子显微镜下进行的。双光子显微镜是一种荧光成像技术,其中两束相干激光通过显微镜的目镜聚焦到由点扩散函数定义的点,类似于选择性激发类荧光分子的共焦显微镜。在双光子显微镜中,激发光的波长接近700-1000nm,接近红外光谱。在体双光子成像的第一个优点是更长波长的光在组织中散射更少,穿透更深;第二个是良好的分辨率,不仅可以显示单个神经元,还可以双光子显微镜中的激光扫描技术也用于在体内成像过程中检测神经元动力学,但区分信号和噪声的激发功率通常需要足够高,从而导致一定程度的漂白,双光子显微镜在成像深度方面受到许多因素深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司(GRIN)晶状体,可以看到更深的大脑区域,但由于物镜的大小,大多数皮层或其他大脑结构通常需要完全移除,为晶状体植入腾出空间,这会对动物造成较大的手术损伤。在大多数情况下,选择大脑表层作为研究区域最合适,因为损伤最小,分辨率更高。双光子显微镜体内钙成像的另一个缺点是由于物镜的大小,动物必须被头部固定。目前实验者通过使用圆柱形或球形跑步机使得动物能够稍微自由移动,或者通过一个虚拟现实场景进一步实现动物自由移动。然而,这种虚拟现实加头部固定成像的方法,已经遭到许多科学家的质疑。一部分研究者认为,头部固定的动物在实验期间一直处在物理约束和情绪压力下,因此无法证明神经元对外界的响应在虚拟现实和自由探索下是等价的。更重要的是,许多社会行为,比如母婴分离、交配和攻击防御行为,都不能用头部固定的实验来研究。基于微型显微镜的单光子活体钙成像,研究人员可以记录自由活动动物的钙信号。该微型显微镜通过与梯度折射率(GRIN)的透镜连接,可完成长时间内群体神经元活动的观察。这种装置体积小,可以固定在动物头上,不会严重阻碍其运动。这项技术的发展使得微型显微镜成为研究发育、神经可塑性和神经退化性疾病的一种非常有用的工具。尽管使用微型显微镜在自由活动的动物中进行钙成像有很强的实用性,但这种方法仍存在一定局限性。与双光子相比,单光子成像背景荧光更高,并且更容易发生光散射。并且在某些行为学实验在应用受限,比如水迷宫和强迫游泳实验。此外,由于GRIN透镜植入物的直径范围为0.5mm~1mm,不可避免地会造成一定范围的组织损伤,这可能会影响研究的关键回路。光纤记录系统原理上主要分为荧光激发系统和收集系统,即向实验动物大脑特定脑区注射一定量的钙染料或遗传编码的钙指示剂,并在相同位置植入一根直径200-深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l光经PMT或CMOS传感器转换为电信号,随后经数据采集卡被传送至记录系统,以达到实时观察所研究脑区群体神经细胞钙荧光活动的目的。并且由于光纤探头的体积小和质量轻,研究人员可以同时对多个大脑区域进行记录。参考文献:advancesininvivocalciummeasurementstrategies[J].AcschemNeurosci.4.使用光纤记录技术应用至嗅觉研究4.1实验设备和材料异氟烷麻醉系统、立体定位仪、数码显微镜或双目体视镜、玻璃微电拉制仪、微量注射泵、剃毛工具、手术刀、眼科摄、眼科剪、棉签、碘伏、AA毒、陶瓷插针、陶瓷插针夹持器、小鼠头部固定杆、颅钻、钻头(0.8mm)、颅钉 (M1.0XL2.0mm)、螺丝刀(45*1mm)、生理盐水、牙托粉水(义齿基托聚合物,自凝型)、红霉素眼膏、抗生素等。4.2术前准备4.2.1确定目标脑区坐标确定目标脑区位点通常有两种策略:①通过使用立体定位图谱,寻找目标脑区具体位置,读取目标脑区深度、矢状、冠状坐标,最终确定目标脑区的三维坐标。○通过阅读参考文献,获取方法中涉及目标脑区的坐标。400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司文献中坐标常用标注:AP:anteroposterior,前购前后;ML:mediolateral,中缝左右;DV:dorsoventral,颅骨(硬脑膜)平面向下。注意事项:文献中坐标选取的z轴参考点包括:面的Z轴读值等。由于病毒表达时间较久,建议先用普通染料做预实验,确定目标脑4.2.2器具消毒、仪器检查实验前使用酒精擦拭手术器械,检查各种实验耗材是否准备完整;检查立体定位4.2.3实验动物准备选取实验动物检查其健康状况,并进行体重称量。4.3动物手术4.3.1动物麻醉及固定400-966-9516l5)用适配器将小鼠固定在脑立体定位仪上,并将异氟烷浓度调整为1.5-2%。小鼠固定在脑立体定位仪上)麻醉深度可通过对脚趾捏合无反应(监测脚趾捏合反应)来确认,手术期间每20min一次。400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司8)在头皮表面下注入0.1ml利多卡因,以提供局部镇痛作用。9)涂抹红霉素眼膏,避光以保护眼睛。4.3.2暴露颅骨1)将小鼠麻醉及固定在适配器上后,从前到后(眼睛之间到颅骨后部)做切2)用蘸有生理盐水的棉签擦拭切口,将头骨表面清理干净,确保头骨干净(没有血液,毛皮或组织)并且干燥(使用干燥的棉签吸生理盐水或血液)。小鼠暴露颅骨4)将连接好玻璃电极的微量注射泵夹持到定位仪深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l量Bregma点左右两侧旁开2.3mm处颅骨的高度差,小于0.03mm则认为左右颅骨水平,大于0.03mm则需要调节耳杆的高度来调整水平;前后方向测量Bregma点和Lambda点的高度差,也需小于0.03mm,若大于0.03mm则上7)在目标标记点处用颅钻进行开颅并挑开硬脑膜。此外还需钻两个预留孔,用于埋植颅钉。如果钻孔过程发生出血,使用棉签清洁血液,再使用一块可吸收的颅骨钻孔4.3.3病毒注射深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司1)从冰箱中取出病毒。4)将玻璃电极针移动至目标位点上方,然后下针至目标位点后(下针过程保持5)注射完成后静置10min10min后将微量注射器抬起(拔针过程保持匀速4.3.4埋植颅钉颅钉(小螺丝)植入深度约0.5mm左右,避免过深压迫大脑,过浅固定不牢小,导致光纤不好埋植;也防止太靠近目标脑区,对目标脑区损伤过大,影响实验结果。颅骨钻孔完成后,还需清理颅骨表面的颅骨碎屑,并用生理盐水清洗并吸干水分或血液,保证颅骨表面干净干燥。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司4.3.5埋植陶瓷插针及固定嗅觉头杆(插针应位于钻头产生的窗口上方)。纤维的底部周围,避免涂到夹持器上。成牙科水泥小心滴涂于头杆和头骨连接处以固定头杆。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司4.4光纤记录与嗅觉行为实验光纤记录系统与嗅觉训练系统联用场景一般分为:①在小鼠接收气味刺激时记录神经元钙信号变化,则可在2-3周钙荧光病毒表达,同步开启嗅觉实验及光纤记录实病毒表达后,先进行嗅觉记忆认知行为前期训练,再结合光纤记录系统同步进行气味4.4.1嗅觉行为训练①小鼠适应头杆及训练环境:将小鼠固定于躯体固定器,放入嗅觉行为训练箱中适应,训练前3天,每天适应5分钟。2小鼠饮水剥夺:训练前24小时,取走小鼠饲养笼水瓶以进行饮水剥夺。①舔水训练:训练小鼠建立舔珉水嘴获得饮水奖励的初步认知,以小鼠能够主动连续舔珉水嘴获得饮水奖励为评估标准,通常训练1-2天即可。实验参数见下深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司2气味相关舔水训练:小鼠建立气味为线索时舔珉水嘴获得饮水奖励的进一步认知,以小鼠在气味释放后主动舔珉水嘴获得饮水奖励的行为正确率达到70%为评估指标,通常训练2-3天即可。实验参数见下图。气味相关舔水训练实验参数1气味相关舔水训练实验参数2深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司味B时,舔珉水嘴不会有饮水奖励,且要求小鼠拒绝舔珉水嘴。以小鼠在GO气味释为的综合正确表现比率达到85%为评估指标,通常训练3-5天即可。实验参数见下图。GO-Nogo范式实验参数1深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司等待时长-ns两次舔水间隔≤ns才视为连续sccm(standardcubiccentimeterperminutes)气流量单位:标况下每分钟1立方厘米(1ml/min)稀释气流-sccm空气气路的气流量Hit总数正确舔水次数odor实验气味动作延迟期伪随机次数每4次Trial执行伪随机规则分配Trial出现顺序及次数主动奖励的Trial次数-n前n次Trial系统自动给水诱导小鼠舔水4.4.2光纤记录结合嗅觉行为实验使用光纤记录系统采集动物在嗅觉行为实验中大脑的钙荧光信号,通过分析软件处理钙荧光信号数据,并结合嗅觉行为实验对动物的行为进行分析。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司1)用BNC线将光纤记录系统和嗅觉行为训练系统连接起来,以在小鼠接收气味刺激和获得饮水奖励时输出TTL信号给光纤记录系统打标。嗅觉训练系统设置TTL信号端口2)将小鼠固定于嗅觉行为箱中,利用套管将光纤与小鼠头部陶瓷插针进行连3)开启嗅觉行为训练系统实验程序及光纤记录系统同步采集荧光信号。5.光纤记录实验注意事项根据光纤记录的实验程序,当信号记录不好时,可以考虑以下因素。5.1仪器连接及参数设置深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l助于采集到荧光信号。调节帧率及曝光时长注意事项:深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司①若未记录到信号,可适当调高光源功率;②动物脑区较大,病毒注射量可适量增加;③病毒注射后也可先不埋植插针,待2-3周后病毒表达,陶瓷插针连接光纤一起植入,边植入插针边检测钙信号。5.2病毒病毒应即拿即用,避免反复冻融。活性低,表达效率低,转染效果差,甚至未表达。建议选择转染效率更高的病毒工具。神经元在相应实验条件下,没有被激活,检测不到信号。5.3病毒注射1)手术前定位:在病毒注射前,我们可以先注射台盼蓝进行预实验进行练习,通过预实验对脑区精准定位,提高后面实验的成功率。脑区坐标定位参考:调平时注意左右高度差小于0.03mmo深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司2)病毒注射:选择较细直径的玻璃电极可以减少注射损伤,对于浅层脑区注射实验,还可以减少病毒泄露。建议病毒注射后留针10mino3)病毒注射检测:切脑片看荧光表达。荧光染色实验拍不出带有荧光的细胞,可能原因是显微镜聚焦未在神经细胞这一层上(如上图出现模糊团状,可能会是细胞)、注射的脑区与病毒反应的特异深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司注意事项:如果没有明显的阳性信号,可能原因有手术中脑区定位有偏差导致病毒注射位置不对(目标脑区很小的话会常存在这个问题)、病毒注射后顺着脑室流走、病毒注射5.4陶瓷插针埋植位置1)病毒注射与陶瓷插针植入可以在同一个手术进行,避免二次手术对小鼠造成3)定期查看定位仪操作臂与夹持器的固定情况,防止角度偏差。4)病毒注射表达区域与陶瓷插针的植入位置需要保持接近,二者位置超过100深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司5.5耗材参数搭配1)光纤记录实验对环境光比较敏感,建议实验在光线相对稳定、昏暗的环境下进行。光纤记录更适合选择黑色陶瓷插针与黑色陶瓷套管,可避免环境光对荧光信号的影响。2)较大数值孔径的耗材有助于荧光信号的传输,所有的配件耗材保持相同的芯3)使用高强度的激光器对光纤进行漂白,使得光纤等耗材的自发荧光降低,减4)检查光纤是否有被小鼠咬破,造成损坏等。5.6仪器问题1)未连接光纤情况下,用灯光如手机手电筒等照射仪器出光口,在软件上观察物镜是否有大量灰尘等脏污,如有,可能平时做完实验没给设备接口带防尘帽,光纤接口镜头里的灰太多,信号检测能力大幅下降。2)以上均没问题,考虑设备故障,用荧光片试一试,看看信号有没有变化。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司6.嗅觉行为实验注意事项估,实验周期约为7-10天,是认知评估的复杂实验中相对高效的行为学训练。实验气味传递的精准度、饮水奖励的稳定性、信号传输的同步性等是决定训练成关键因素,为更高效的达标记忆训练,我们从以下几个方向小结了实验过程中的注意事项,供大家快速定位解决问题。6.1仪器连接及系统设置1)仪器连接开启后,软件显示如下系统报错:应注意软件-帮助-产品规格的选择与实际仪器规格是否匹配,此处报错为常规款仪器错误选择了"电生理兼容款"产品规格,切换正确即可。2)软件安装后无法打开或打开后出现持续卡顿时,请检查PC系统版本,olfactometer软件对pc系统要求最低为windows10深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司6.2训练过程注意事项1)行为学实验操作应尽可能轻柔操作,建议于实验开始前三天对小鼠实施抚摸陪同玩耍行为,如使用棉麻手套则训练全过2)小鼠禁水时长应适度,时长过短会导致禁水程度不够小鼠不配合训练,时长过长会导致小鼠脱水严重小鼠状态不佳无法配合训练,更重要的是有损小鼠健康,不符合动物实验伦理原则。3)实验需在安静环境下进行,实验过程中实验人员应保持安静,不可高声谈论,不可用力关门发出尖锐噪声等。4)在结束每天的训练后给小鼠提供自由饮水0.5-1.0小时很重要,有利于维持小鼠健康状态及保持小鼠每次训练禁水状态的一致性。5)建议在每次训练开始启动程序测试水嘴出水,确保小鼠放入行为箱后即顺利6)训练全过程应保持水嘴奖励侧选择的一致性,始终使用双侧水嘴或始终使用6.3实验参数设置至8ul,以使得小鼠在当次训练过程中得保持好的状态完成全部训练;session和trial参数的设置应相互协调,结合单次奖励量计算出当次实验的合适session400-966-9516lrwd400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司7.嗅觉研究数据实验范式的训练和测试,不同阶段的数据形式略有不同,但核心参数始终一致,例如Hit、Miss、Falsechoice、correctrejection,用于判断小鼠学习行为的达标程度,7.1数据采集量,实时计算小鼠舔水行为表现值,以Hit、Miss、Falsechoicecorrectrejection的次数和百分比两种形式体现,并计算给出performancecorrectRat(正确表现比率)。同时,在训练详情界面的下方会实时显示系统气路状态,方便实验人员获取气味释放信息。如下图所示:深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司在嗅觉行为训练过程中软件已实时采集统计各项结果参数,在实验结束后,Results和Events数据以.csv格式文件进行存储。Results.csv文件统计给出了嗅觉行为训练的关键结果参数,包括Hit、Miss、Falsechoice、correctrejection的次数和百分比两种形式,以及performancorrectRate(正确表现比率)。如我们在嗅觉行为训练实验方法提到的,以小鼠在拒绝行为的综合正确表现比率达到85%为评估指标,performancecorrectRate85%,小鼠训练达标视为学会了气味区分,performancecorrectRate<85%,小Events.csv数据文件以时间轴线记录了该实验程序全过程事件,相当于原始数据,可抓取数据用第三方软件进一步作图分析。但通常而言,在Results.csv文件给出的关键结果参数已能满足嗅觉行为训练实验的数据作图需求。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司8.光纤记录数据分析光纤记录的原始数据包含时间轴、不同通道对应的荧光值、事件标记信息。通过分析相对于初始基线荧光(F)的荧光变化()并观察与钙瞬变相对应反应。考虑到GcaMP只有在与钙离子结合时才会引发荧光增强,和jrGECO1a,同时使用独特的410nmLED来获取对照信号并排除噪声。数据分析可以使用不同的软件进行,如MATLAB、python或您选择的其他分析8.1数据预处理400-966-9516lR821三色光纤记录系统软件集信号采集与数据分析于一体,在数据分析中,数据预处理过程包含平滑处理,基线矫正,运动矫正等功能正多数针对的是荧光信号因长时间记录导致漂白信号逐步下降,或者光纤的自发荧光在长期记录下逐步被漂白、基线逐步下降等情况。此情形的数据因为整体呈势,不利于后续数据作图分析,所以需要进行基线矫正。运动矫正采用410nm对照通道的数据,410nm数据可以用于反应背景噪音信号,运动矫正即将410nm数据与470nm数据进行拟合,通过算法从470nm数据中去除410nm数据的波动,得到真实的荧光数据。8.2分析作图将荧光数据与动物行为数据同步对比,选择事件标记或者增加事件标记,对事件相关信号分析作图。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司事件分析8.3组间对比将不同组的数据进行组间对比,即可分析不同处理因素下荧光数据的差异。此外,还可结合行为学视频同步分析动物的运动轨迹。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司通过以上步骤,原始的荧光数据就可以直接出图。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司第三章光纤记录与嗅觉研究应用在本章中,我们将简单介绍一下光纤记录系统和嗅觉行为训练系统,并展示一些真实的实验示例,这些示例将有助于启发您的实验设计。410nm可以用来反射背景噪声信号,从而确保获得真实的荧光数据。R821三色多通道光纤记录系统有三个激发光源(410nm、470nm和560nm)。该系统可以记录绿色荧光指示剂如GcaMP和dlight或神经递质探针的信号,以及红色荧光指示剂如RcaMP、jrGECO1a或神经递质探针的信号。瑞沃德嗅觉行为训练系统有16气瓶常规款(OM-16)、8气瓶常规款(OM-8)、16气瓶电生理兼容款(OM-16E)可供选择,可用于小鼠学习记忆训练,基于嗅觉刺激关联饮水奖励反馈,建立认知学习范式,帮助用户快速开展记忆认知相关实嗅觉行为训练系统支持多只动物进行多种气味训练,包气味控制、信号传输、行为相机、隔音箱、桌面软件等模块,可拓展与光遗传、光纤记录、电生理等第三方设备联用。配有专用软件操控系统运行,精确控制气味释放,新程序。400-966-9516l嗅觉行为训练系统可实现气味刺激、嗅觉分辨、认知训练等实验任务,助力开展嗅觉功能、学习记忆认知、神经系统疾病等机制的研究,大大提瑞沃德嗅觉行为训练系统3.光纤记录与嗅觉研究应用案例5.嗅觉行为训练系统应用案例1.光纤记录系统主要功能特点1.1软件功能强大1.1.1一键出图荧光热图、曲线图、动物轨迹图等,支持一键分析出图,省时省力。1.1.2一体化采集多种事件打标方式,包括:①外部信号输入自动标记实时显示,自由修改颜色;②手动标记实时显示,自由修改事件名称、颜色及快捷键;③行为学Rol标记实时显示,自由修改事件名称及颜色等,根据实验需求自由选择。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lRol事件输出,实现闭环研究;②荧光信号实时输出:采集数据实时传输至MATLAB,实时分析及闭环调控,进行个性化1.1.3全方位数据分析据处理功能。2)多维度结果输出。可输出deltaF/F、Z-score、peak统计、组间对比、事件步播放,行为学视频可逐帧查看及处理。1.2系统集成高效1.2.1高集成化析,无需分开使用。兼容光遗传。内置光遗传接口,实现同位点刺激和记录。1.2.2强拓展性深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司1.3性能稳定1.3.1超100小时稳定采集1)高稳定LED光源OLED激发光源功率稳定,8小时连续输出功率不稳定度小于0.5%;寿命>10000小时,为稳定采集保驾护航。2)低丢帧率相机。采集丢帧率低,小于0.02%,保证数据信号的真实性。3)独特软件控制系统。独特的数据采集控制及存储算法,保障了系统不卡顿、1.4采集灵敏扰,获得准确信号。弱信号检测需求;250FPS高帧率,满足微弱且快速变化的信号需求。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司干扰,信号采集更精准。2.嗅觉行为训练系统主要功能特点2.1高通量单个电脑工作站可控制8通道箱体,实现8只小鼠同步训练。2.2高灵敏度气味切换迅速毫秒级别响应,舔水传感模块灵敏精准计数。2.3一体化气味刺激模块与舔水奖励模块关联,一体化实现学习记忆训练。2.4自动化2.5强兼容性2.6视频监控3.光纤记录与嗅觉研究应用案例由于光纤记录实验的高效简便,从该技术发明以来,已有近千篇文章发表;近年来嗅觉方向的研究也渐渐为研究人员所关注,嗅觉行为训练实验中结合光纤记录系统深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l对钙信号进行记录,分析神经元信号的变化,已成为研究人员探究嗅觉功能及认知活动中的重要技术手段。下面为大家举例光纤记录与嗅觉研究应用的几个案例,帮助大3.1外侧内嗅皮层直接编码奖赏关联性学习记忆越来越多的证据表明纹状体多巴胺与奖赏关联性学习密切相关,研究也发现内嗅皮层-海马通路是编码关联学习的关键环路。内侧内嗅 (LEC)在编码记忆信息上的差异也广泛被研究人员关注,外侧内嗅皮层在编码与物体气味,形状等特征信息相关的记忆时,与多巴胺奖赏信号的神经环路连接尚未阐光纤记录系统、单细胞电生理记录等技术手段,发现外侧内嗅皮层海马通路是编码奖赏相关的学习记忆的关键环路,这一过程依赖于多巴胺和扇形细胞。研究团队利用正确的次数在80%以上,就认为小鼠成功获得习得性关联记忆。400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司LEC扇形细胞在奖赏关联性学习中起关键作用深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司参考文献:Natur2021,598(7880),321-326.3.2眶额皮层-纹状体回路中细胞类型特异性影响强迫症认知僵化许多精神疾病表现出认知僵化性功能障碍,无法灵活调整行为以适应不断变化的环境的要求,这是强迫症(OCD)的主要症状,通常表现为逆转学习受损。在强迫症的研究中,已经知道眼眶额叶皮层(OFC)转学习缺陷有关。首都医科大学的研究团队利用经典的气味刺激关联舔水奖励实验范式设计了逆转学习任务,同时联用光遗传学及光纤记录系统,发现眶额皮层活动是正常逆转学习和细胞类型特异性功能障碍的基础。当发生细胞类型特异性功能性增加减少,这导致对OFC兴奋性神经元的抑制不足,进而影响对奖励与非奖励线索的响应偏好,最终导致逆转学习变慢。该研究结果为探究强迫症认知僵化的潜在治400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司参考文献:yang,z.;wu,G.;Liu,M.;sun,x.;xu,Q.;zhang,c.,etal.DysfunctionofMouseModelofobsessive-compulsiveDisorder.currBiol2021,31(2),381-393e4.400-966-9516l4.光纤记录应用案例为大家举例光纤记录应用案例,帮助大家更好地了解光纤记录在神经系统疾病中的应用,本案例使用瑞沃德多通道光纤记录系统完成数据采集及分析工作。4.1记忆下丘脑环路调控海马神经发生促进记忆提取对抗焦虑样行为生、成熟并整合到现有环路中,并且这个过程由神经环路的活动进行动态调节。然Li等人聚焦于SUM-DG环路修饰的ABN发育的不同阶段,通过光纤记录、光遗传、化学遗传、膜片钳和谱系示踪等方法,揭示了SUM-DG环路修饰成年海马新生神经元,促进记忆提取和对抗焦虑。在该研究中,Li等人使用光纤记录方法检测SUM-DG神经元投射的活性,结果发现在丰富环境(EE)中,小鼠SUM神经元活性显著增加,并且SUM消融后,EE诱导的神经反应和ABN介导的行为改善被消除,提示SUM-DG环路修饰的ABN能深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司参考文献:Liya-Dong,Luoyan-Jia,chenze-kaetal.Hypothalamicmodulationofadultmemoryandanxiety-likebehavior.[J].NatNeurosci,2022,25:630-645.5.嗅觉行为训练系统应用案例在动物实验研究中,嗅觉作为驱动认知行为的重要感觉模式,在嗅觉辨别、学习记忆、决策、冲动等认知行为中发挥重要作用。临床研究也发现,许多脑部病变的发生都伴随着嗅觉障碍,例如头部外伤、丘脑或前额叶皮质病变、颅内压增高等病变,等神经系统疾病中也存在嗅觉障碍。基于嗅觉刺激的行为学实验在相关研究中应用广泛,推动了认知及神经系统疾病机制的研究进展。下面将为大家举例嗅觉行为训练实验应用案例,帮助大家更好地了解嗅觉行为训练系统在神经研究领域中的应用。5.1延迟期间的内侧前额叶活动有助于学习工作记忆任务工作记忆(WM)是认知过程的重要部分,涉及一段短暂的记忆保留期,称为延迟期。多项研究表明在延迟期内侧前额叶皮层(mpFC)活性升高,一篇发表在science上的研究进一步揭示了其在工作记忆任务中的功能作用。研究人员利用气味果发现嗅觉行为学习表现在学习阶段会受到损害,但在小鼠接受良好训练后则不会。研究人员训练小鼠在气味移除的短暂时间内记住该气味,在此延迟期间光遗传学操纵小鼠内侧前额叶皮层中的神经细胞活动会干扰小鼠在延迟期后闻到相同或不同气味时的舔水行为表现。一旦小鼠成功学会DNMS任务,光遗传操纵就不会影响随后的舔深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lmpFC)神经元活动对于学习工作记忆任务期间的400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司抑制延迟期mpFC活动损害了工作记忆任务学习的表现参考文献:深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司第四章光纤记录应用至嗅觉研究实验设备及耗材瑞沃德在进行光纤记录应用至嗅觉研究实验的整体解决方案如下图所示,包括麻1.麻醉定位3.结合嗅觉行为实验进行荧光信号采集4.切片染色1.麻醉定位在给动物做手术时,动物需要保持持续麻醉状态,且此时动物头部也处于固定状态。所用设备:脑立体定位仪、麻醉机、呼吸机、数码显微镜或双目体视镜、体温维2.病毒注射、插针埋植及头杆固定动物固定及调平后,首先要定位到研究的目标脑区位点并进行开颅手术,然后根深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l据实验设计,吸取对应的荧光蛋白病毒并注射到目标位点中,最后在相同位点植入陶瓷插针并通过牙托水泥固定。所用设备及耗材: