药品制造过程课件

第三章药品制造过程药品制造过程3.1药典(pharmacopoeia)

是一个国家记载药品标准、规格的法典，一般由国家卫生行政部门主持编纂、颁布实施，国际性药典则由公认的国际组织或有关国家协商编订。药品制造过程

药品标准是药品现代化生产和质量管理的重要组成部分，是药品生产、供应、使用和监督管理部门共同遵循的法定依据。

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药品质量的内涵包括三方面：真伪、纯度、品质优良度。三者的集中表现是使用中的有效性和安全性。因此，药品标准一般包括以下内容：法定名称、来源、性状、鉴别、纯度检查、含量（效价或活性）测定、类别、剂量、规格、贮藏、制剂等等。药品制造过程3.1.1中国药典(Ch.P)

始自1930年出版的《中华药典》。1949年中华人民共和国成立后，已编订了《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）1953、1963、1977、1985、1990、1995、2000、2005年版共八个版次。

药品制造过程2005年版药典的制订

2002年10月经国家药品监督管理局（2003年9月更名为国家食品药品监督管理局）批准，第八届药典委员会成立。药品制造过程2002年10月召开第八届药典委员会全体大会及执行委员会第一次会议，通过了本届药典委员会提出的“《中国药典》2005年版设计方案”。决定将《中国生物制品规程》并人药典，设为药典三部；并编制首部中成药《临床用药须知》。

药品制造过程《中国药典》2005年版经过第八届药典委员会执行委员会议审议通过，12月报请国家食品药品监督管理局批准颁布，于2005年1月出版发行，2005年7月1日起正式执行。药品制造过程

本版药典收载的品种有较大幅度的增加。共收载3214种，其中新增525种。药典一部收载品种1146种，其中新增154种、修订453种；药典二部收载1967种，其中新增327种、修订522种；药典三部收载101种，其中新增44种、修订57种。药品制造过程

本版药典在主任委员的积极倡导下，对药品的安全性问题更加重视。药典一部采用原子吸收和电感耦合等离子体质谱法增加了有害元素（铅、镉、砷、汞、铜）测定法，并规定了有害元素的限度；药典一部还增加了中药注射剂安全性检查法应用指导原则。

药品制造过程3.1.2英国药典(BP)

自1864年第一版起，已出至第14版。现行版为1988年版。该药典从1980年版起改为两卷本。第一卷收载绪论，通则和原料药品以及红外对照图谱等；第二卷收载各类药品制剂、血液制品、免疫制品、放射性药品、手术用品以及附录和索引等。1988年版收载各类药品2100种,其中有495种为《欧洲药典》已收载的品种。

药品制造过程3.1.3美国药典(USP)

创始于1820年,迄今已出至第22版。现行版为1990年版。该药典自1980年版起与《国家药方集》(NF)合并。USP收载原料药品及其制剂,而NF收载各类辅料和一些非处方药。根据美国药典委员会1975年第3号决议,凡已被批准投放市场的药物均应载入药典。现行版《美国药典》(USPXXII-NFXVIII)收载各类药品3204种，是目前世界上规模最大的一部药典。

药品制造过程3.1.4欧洲药典(Ph.Eur)1963年欧洲共同体各国共同商定编订《欧洲药典》，于1969年开始出第一版,分3卷陆续出版发行，其法文版和英文版为法定版本。1980年开始出第二版,并陆续分期出版，截止1990年6月已分期出至第14分册。该版药典共收载药品704种。

药品制造过程3.1.5国际药典(Ph.Int)

由联合国世界卫生组织主持编订。第一版于1951和1955年分两卷用英、法、西班牙文出版，于1959出版增补本。第二版于1967年用英、法、俄、西班牙文出版。现行版为第三版，于1979、1981、1988年、1994、2003分5卷出版。药品制造过程

第1卷收载42项分析测试方法。第2、3两卷共收载药品383种。第4卷收载有关试验、方法的信息，以及药品原料、赋形剂的一般要求和质量说明，以及剂型。第5卷收载制剂通则以及药品原料和片剂的质量标准。

药品制造过程3.1.6马丁代尔大药典（MartindaletheExtraPharmacopoeia）由英国大不列颠药物学会(ThePharmaceuticalSocietyofBritain)的药物科学部(DepartmentofPharmaceuticalScience)所属的药典出版社(ThePharmaceuticalPress)编辑出版的一部非法定药典。因其编者MilliamMartindale而得名。

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全书分为三个部分，第一部分为医院制剂，按药物作用类别分类；第二部分为辅助药物部分，按字顺排序；第三部分为专利药物部分。书末附有厂商索引、药物临床用途索引和总索引。从1883年第一版起最新版为2007年的第35版。药品制造过程

该数据库收录了5,500多篇药物专论、6万种专利制剂、600种疾病治疗顾问、200篇草药专论、5000种草药制剂和32个国家的10,900多家生产商的信息。可方便快捷地检索药品的用法、副作用、分子式、同义药名、制造商及商品名信息。

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3.2优良药品制造规范指南GMP（GoodManufacturingPracticesforDrugs）药品制造过程3.2.1

GMP的历史

是社会发展中医药实践经验教训的总结和人类智慧的结晶。在此之前，人类社会经历了12次较大药物灾难，特别是20世纪最大的药物灾难“反应停”事件后引起公众的不安和对药品监督的关心。

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反应停于1953年首先由西德一家制药公司合成，1956年进入临床并在市场试销，1957年获西德专利，这种药物治疗早孕期间的孕吐反应，有很好的止吐作用，对孕妇无明显毒副作用，相继在51个国家获准销售。药品制造过程

从1956年反应停进入市场至1962年撤药，全世界30多个国家和地区(包括我国台湾省)共报告了"海豹胎1万余例，各个国家畸形儿的发生率与同期反应停的销售量呈正相关，如在西德就引起至少6000例畸胎，英国出生了5500个这样的畸胎，日本约1000余例，台湾省也至少有69例畸胎出生。

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只有美国，由于官方采取了谨慎态度，没有引进这种药，因此，除自己从国外带入服用者造成数例畸胎外，基本没有发生这样病例。

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反应停所造成的胎儿畸形，成为20世纪最大的药物导致先天畸形的灾难性事件，至今仍有法律纠纷。反应停是第一个被明确为人类致畸的药物。此后全世界进行了大规模的药物致畸的研究，结果发现了不少药物有不同程度的致畸作用。

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反应停对人与动物的一般毒性极低，如服用14克并不使人死亡。但其可选择性地作用于胚胎，对胚胎的毒性明显大于母体，其对胎儿的致畸作用可高达50%一80%，如在妊娠第3--8周服用，其后代畸形发生率可高达100%，对人胚胎的致畸剂量为1毫克/千克。

药品制造过程GMP最初由美国坦普尔大学6名教授编写制订

1963年颁布成为法令

1967年WHO《国际药典》的附录中收载1969年第22届世界卫生会，WHO建议各国采用GMP制度1973年，日本提出了自己的GMP，1974年颁布试行1975年WHO正式公布GMP1977年第28届世界大会WHO确定GMP为法规1978年，美国修订GMP1980年日本正式实施GMP到目前为止，已有100多个国家实行了GMP制度。药品制造过程3.2.2中国GMP认证的历史药品制造过程

过去“三检三把关”：三检：自检、互检、专职检验

三把关：把好原、辅、包材关，把好中间体质量关把好成品质量关。

1982年中国医药工业公司制订了《药品生产管理规范（试行本）》

1985年，经修订后由国家医药管理局推行颁布

《药品生产管理规范实施指南》（85年版）1988年卫生部颁布《药品生产质量管理规范》

药品制造过程1992年，卫生部修订颁布《药品生产质量管理规范》

1993年中国医药工业公司修订《药品生产管理规范实施指南》

1995年，开始GMP认证工作。

1998年，国家药品监督管理局颁布98修订版GMP

同时规定在3到5年内，血液制品、粉针剂、大输液、基因工程产品和小容量注射剂等剂型，产品的生产要达到GMP要求，并通过GMP认证。

实施GMP工作与《许可证》换发及年检相结合顺规定期限内未取得“药品GMP证书”的企业或车间，将取消其相应生产资格。药品制造过程3.2.3实施GMP目的1.提高制药企业的科学管理水平，促进企业人员素质提高和增强质量意识，保证药品质量。2.为制药企业提供一套药品生产和质量所遵循的基本原则和必需的标准组合。3.有利于药品的出口。4.国家限期的强制性的认证。药品制造过程影响产品质量的五大因素人（Human）机器设备（Machine）物料（Material）方法（Mwthod）环境（Environment）药品制造过程GMP认证是全面质量管理在制药行业的体现，<<中华人民共和国标准化法实施条例>>第十八条规定：“国家标准、行业标准分为强制性标准和推荐性标准"。而药品标准属于强制性标准。

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国家药品监督管理局是代表国家对药品独立地进行第三方公正评价的GMP认证机构。迄至1998年6月31日末取得认证的企业，药品监督管理部门将不再受理新药生产的申请。

药品制造过程3.2.4GMP认证的内容1、机构与人员2、厂房与设施3、设备4、物料5、卫生6、验证药品制造过程7、文件8、生产管理9、质量管理10、产品销售与收回11、不良反应与用户投诉12、自检药品制造过程一、机构与人员检查项目*0301—0701共17项其中关键项目8项，一般项目9项药品制造过程1、GMP的机构人员原则：人员是建立并保持良好的质量体系，实施GMP的第一要素。1）、足够的具有实践经验的合格人员（具有相应资力、经过培训）2）、明确职务分工及自身职责（职务授权、订立书面岗位职责）3）、所有人员都应理解GMP的原则（GMP教育、培训）药品制造过程2、GMP对企业配备各级管理人员的资历要求：（*0401）主管生产和质量的企业负责人具有医学、药学或相关专业大专学历；（相关理工科专业，如：化学、生物学、化学工程、生物工程等）具有药品生产和质量管理经验；（管理经验一般应具有3年以上药品生产管理或质量管理实践）药品制造过程（*0403）对中药生产企业主管生产和质量管理负责人的特别要求：具有中药专业知识（具备中药学中专及大专学历、经国家认可院校半年以上中药专业培训及资质、中药师、执业中药师）。药品制造过程（*05010）企业生产部门和质量管理部门负责人资历要求：具有医学、药学或相关专业大专以上学历（相关专业同上）；具有药品生产和质量管理实践经验（3年以上管理工作）；具有判断处理实际问题的能力药品制造过程（*0402）对生物制品企业、生产部门、质量管理部门负责人增加的特别要求：具有相应专业知识学习（细菌学、病毒学、生物学、分子生物学、生物化学、免疫学、医学、药学）。具有丰富实践经验（3年以上生物制品生产、质量管理工作经验）。药品制造过程（*0502）生产部门、质量管理部门负责人为关键人员必须为全职人员，不得兼职、不得相互兼任。药品制造过程2、GMP对企业各类技术人员的知识技能要求：各类技术及工作人员应经相应专业技术培训后上岗

1）、（0603）对操作人员要求经基础理论及实际操作培训并考核合格后上岗。（有培训记录及考核合格记录）

2）、（0604）对原料有生产人员要求经过原料药生产工艺知识特定操作技能培训并考核合格后上岗。（有培训记录及考核合格记录）药品制造过程

3）、（0605）对中药企业验收人员要求具有识别药材真伪、优劣的技能，并经相关知识（中药鉴定学、中药炮制学中与本企业有关药材的内容培训、药学中专学历视为培训合格）培训并考核合格证上岗。（有培训记录及考核合格记录）

4）、（*0606）对QC人员要求：经药监部门认可的技术部门（如药检所）培训考核合格后上岗。（省、市级中药专业；分析检验专业大、中专学历视为合格；中学学历及其它专业人员须经省、市药检所培训1个月以上；有培训记录及考核合格证书）药品制造过程5）、（0607）对特殊要求药品生产及检验人员的特别要求：须经所生产特殊药品生产知识及技能、安全防护知识及技能的专门培训并考核合格后上岗。（有培训记录及考核合格记录）

6）、（0608）对生物制品企业人员的特别要求：须经所生产生物制品生产知识及技能、安全防护及技能的专门培训并考核合格后上岗。（有培训记录及考核合格记录）药品制造过程

3、企业应建立有对各级员工的培训制度、培训计划和培训档案。

1）、（*0602）企业负责人及各级管理人员应经药品管理法律、法规定期培训，有培训计划及培训记录。

2）、（0701）企业全体员工应经GMP规范的定期培训和考核，有培训计划、培训记录及考核记录。

3）、（0609）对所有进入洁净区人员须定期进行卫生和微生物学知识，洁净生产作业的培训及考核，有培训计划、培训记录、考核记录。药品制造过程二、厂房与设施共72项，其中关键项目32项，一般项目40项检查项目0801—3003药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程1、GMP的厂房设施原则：

1）、空间面积适应生产需要，布局合理。

2）、能有效控制差错和污染。

3）、便于维护和清洁。药品制造过程（0801）企业的生产环境应整洁；厂区地面、路面及运输等不应对药品生产造成污染；生产、行政、生活和辅助区总体布局应合理，不得互相妨碍。药品制造过程（0901）厂房应按生产工艺流程及所要求的空气洁净度级别进行合理布局。厂房内按工艺中物流最短路线，顺流布局。辅助间位置合理，洁净生产区的级别划分应符合GMP附录的要求，布局尽可能做到“同一级别集中在同一个区，同一个级别在同一个平面。”药品制造过程（0902）同一厂房内的生产操作和相邻厂房之间的生产操作不得相互防碍。厂房按洁污合理分隔厂房内应按工序合理分隔药品制造过程（1001）厂房应有防止昆虫和其它动物进入的有效设施。厂房直通外界的门、窗设有防止昆虫、动物进入的有效设施药品制造过程

（1101）洁净室（区）的内表面应平整光滑、无裂缝、接口严密、无颗粒物脱落、耐受清洗和消毒。（1102）洁净室（区）的墙壁与地面的交界处应成弧形或采取其他措施，以减少灰尘积聚和便于清洁。药品制造过程（1601）洁净室（区）的窗户、天棚及进入室内的管道、风口、灯具与墙壁或天棚的连接部位应密封。（1101）对洁净室（区）内表面要求：墙面、地面平整无缝、光滑耐磨、易清洁。药品制造过程

（1103）中药生产的非洁净厂房地面、墙壁、天棚等内表面应平整，易于清洁，不易脱落，无霉迹。药品制造过程（1201）生产区应有与生产规模相适应的面积和空间用以安置设备、物料，便于生产操作，避免差错和交叉污染。

药品制造过程（1301）洁净室（区）内各种管道、灯具、风口以及其他公用设施应易于清洁。其他公用设施，如工具、模具、洁具、容器、物架（柜），其材质及选型应易于清洁（坐橙、地架、台车、衣柜、工具柜等不易清洁，尽可能不用，特别是无菌区更要严格控制使用）药品制造过程

（1401）洁净室（区）应根据生产要求提供足够的照明。主要工作室的照度应达到300勒克斯；对照度有特殊要求的生产部位应设置局部照明。厂房应有应急照明设施。药品制造过程

（1501）进入洁净室（区）的空气必须净化，并根据生产工艺要求划分空气洁净度级别。药品生产洁净室（区）的空气洁净度划分为四个级别：药品制造过程

（1502）洁净室（区）空气的微生物数和尘粒数应定期监测，监测结果应记录存档。洁净室（区）在静态条件下检测的尘埃粒子数、浮游菌数或沉降菌数应符合规定。（1503）非最终灭菌的无菌制剂应在百级区域下进行动态监测微生物数。药品制造过程

（1504）洁净室（区）的净化空气如可循环使用，应采取有效措施避免污染和交叉污染。（1505）产尘量大的洁净室（区）经捕尘处理不能避免交叉污染时，其空气净化系统不得利用回风。药品制造过程

（1506）空气净化系统应按规定清洁、维修、保养并作记录。（1602）空气洁净度等级不同的相邻房间（区域）之间或规定保持相对负压的相邻房间（区域）之间的静压差应符合规定，应有指示压差的装置，并记录压差。（1603）空气洁净度等级相同的区域内，产尘量大的操作室应保持相对负压。药品制造过程

（1701）洁净室（区）的温度和相对湿度应与药品生产工艺要求相适应。无特殊要求时，温度应控制在18-26℃，相对湿度应控制在45%-65%。（1801）洁净室（区）的水池、地漏不得对药品产生污染，100级洁净室（区）内不得设置地漏。药品制造过程

（1901）不同空气洁净度级别的洁净室（区）之间的人员和物料出入，应有防止交叉污染的措施。（1902）10,000级洁净室（区）使用的传输设备不得穿越空气洁净度较低级别区域。（1903）洁净室（区）与非洁净室（区）之间应设置缓冲设施，洁净室（区）人流、物流走向应合理。药品制造过程

（2501）与药品直接接触的干燥用空气、压缩空气和惰性气体应经净化处理，符合生产要求。（2601）仓储区应保持清洁和干燥，应安装照明和通风设施。仓储区的温度、湿度控制应符合储存要求，按规定定期监测。（2602）如仓储区设物料取样室，取样环境的空气洁净级别应与生产要求一致。如不在取样室取样，取样时应有防止污染和交叉污染的措施。药品制造过程

（2801）质量管理部门根据需要设置的实验室、中药标本室、留样观察以及其他各类实验室应与药品生产区分开。（2802）生物检定、微生物限度检定和放射性同位素检定等应分室进行。（2901）有特殊要求的仪器、仪表应安放在专门的仪器室内，应有防止静电、震动、潮湿或其它外界因素影响的设施。药品制造过程

（3001）实验动物房应与其它区域严格分开，实验动物应符合国家有关规定。（3002）用于生物制品生产的动物室、质量检定动物室应与制品生产区分开。（3003）生物制品所使用动物的饲养管理要求，应符合实验动物管理规定。药品制造过程三、设备

GMP的设备原则

1）、精度适应生产要求（差错风险最低）。

2）、便于进行有效清洁和维护（避免污染）。

3）、不对产品产生污染。药品制造过程

（3101）设备的设计、选型、安装是否符合生产要求，易于清洗、消毒或灭菌，是否便于生产操作和维修、保养，是否能防止差错和减少污染。

药品制造过程

（3102

）

灭菌柜的能力是否与生产相适应，是否具有自动监测及记录装置。

1.根据灭菌柜的容量计算理论批次量和实际的生产批量，检查能否在规定的时间内完成灭菌。

2.灭菌柜是否有自动监测和记录装置。

3.自动监测记录是否纳入批生产记录。

药品制造过程

3201

与药品直接接触的设备表面是否光洁、平整、易清洗或消毒、耐腐蚀，不与药品发生化学变化或吸附药品。

3202

洁净室（区）内设备保温层表面是否平整、光洁、无颗粒性物质脱落。

3204

与药液直接接触的设备、容器具、管路、阀门、输送泵等是否采用优质耐腐蚀材质，管路的安装是否尽量减少连（焊）接处。药品制造过程

（3202）洁净室（区）内设备保温层表面应平整、光洁，不得有颗粒性等物质脱落。（3203）无菌药品生产中与药液接触的设备、容器具、管路、阀门、输送泵等应采用优质耐腐蚀材质，管路的安装应尽量减少连接或焊接。（3204）无菌药品生产中过滤器材不得吸附药液组份和释放异物，禁止使用含有石棉的过滤器材。药品制造过程（3205）生产过程中应避免使用易碎、易脱屑、易长霉器具；使用筛网时应有防止因筛网断裂而造成污染的措施。（3206）原料药生产中难以清洁的特定类型的设备可专用于特定的中间产品、原料药的生产或贮存。药品制造过程（3208）设备所用的润滑剂、冷却剂等不得对药品或容器造成污染。（3301）与设备连接的主要固定管道应标明管内物料名称、流向。药品制造过程

（3401）纯化水的制备、储存和分配应能防止微生物的滋生和污染。（3402）注射用水的制备、储存和分配应能防止微生物的滋生和污染，储罐的通气口应安装不脱落纤维的疏水性除菌滤器，储存应采用80℃以上保温、65℃以上保温循环或4℃以下保温循环。生物制品生产用注射用水应在制备后6小时内使用；制备后4小时内灭菌72小时内使用。药品制造过程

（3403）储罐和输送管道所用材料应无毒、耐腐蚀，管道的设计和安装应避死角、盲管，应规定储罐和管道清洗、灭菌周期。（3404）水处理及其配套系统的设计、安装和维护应能确保供水达到设定的质量标准。药品制造过程

（3501）用于生产和检验的仪器、仪表、量具、衡器等，其适用范围和精密度应符合生产和检验要求，应有明显的合格标志，应定期校验。（3601）生产设备应有明显的状态标志。药品制造过程

（3602）生产设备应定期维修、保养。设备安装、维修、保养的操作不得影响产品的质量。（3603）不合格的设备如有可能应搬出生产区，未搬出前应有明显状态标志。（3604）非无菌药品的干燥设备进风品应有过滤装置，出风品应有防止空气倒流装置。药品制造过程

（3701）生产、检验设备应有使用、维修、保养记录，并由专人管理。（3702）生产用模具的采购、验收、保管、维护、发放及报废应制定相应管理制度，应设专人专柜保管。药品制造过程3.2.5药品生产企业GMP认证程序一、办理程序：1、申请2、材料审查3、受理4、现场检查5、报省局认证药品制造过程二、范围：三、申报材料：1、《药品生产许可证》、《企业法人营业执照》复印件；2、自查报告；3、组织机构图；4、药品生产企业负责人、部门负责人简历；药学及相关专业技术人员、技术工人登记表；5、生产剂型和品种表；药品制造过程6、企业周围环境图、总平面图、仓储平面布置图及质量检验场所平面布置图；7、药品生产车间概况及工艺布局平面图；空气净化系统送、回风平面布置图；工艺设备平面布置图；8、申请认证剂型或品种的工艺流程图；9、验证情况；仪器、仪表校验情况；10、药品生产、质量管理文件目录；11、省辖市药品检验所出具的洁净室（区）性能检测报告；12、提供消防、环保证明药品制造过程四、承诺时限：1、材料审查：收到真实完整的申请材料5个工作日内完成材料审查。2、受理：通过材料审查时即为受理日。3、现场检查：受理后5个工作日内，组织现场检查。4、上报省局：通过现场检查的5个工作日内，报省局申请认证。药品制造过程药品制造车间药品制造过程１、洁净间２、清洁、净化、消毒（CDS）３、制造用水４、文件药品制造过程１、洁净间１.１基本概念

洁净间（区）（

clean

room

(area)

）：需要对尘粒及微生物含量进行控制的房间（区域）。其建筑结构、装备及其作用均具有减少对该房间（区域）内污染源的介入，产生和滞留的功能。

药品制造过程

空气净化

（

air

purification

）：去除空气中的污染物质，使空气洁净的行为。

洁净度

（

cleanliness

）：洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某一粒径的悬浮粒子的允许统计数。药品制造过程

局部空气净化

：仅使室内工作区域特定局部空间的空气含悬浮粒子浓度达到规定的空气洁净度级别，这种方式称局部空气净化。

药品制造过程

药品生产洁净室（区）的空气洁净度划分为四个级别：药品制造过程１.２药品生产环境空气洁净度要求

1、最终灭菌药品：

100-10

万级

2、非最终灭菌药品：

10

万级

-30

万级

3、其他灭菌药品：

1

万级供角膜创伤或手术用滴眼剂的配制和灌装。

4、洁净工作服：

10

万级以上区域的洁净工作服应在洁净室（区）内洗涤、干燥、整理，必要时应按要求灭菌。

药品制造过程5、原料药生产环境空气洁净度要求

（

1

）法定药品标准中列有无菌检查项目的原料药，其暴露环境应为

1

万级以下局部

100

级。

（

2

）其他原料药的生产暴露环境应不低于

30

万级。6、生物制品生产环境空气洁净度要求：

100-10

万级。7、放射性药品生产环境空气洁净度要求：同灭菌药品、非灭菌药品和原料药中的规定；放射免疫分析药盒各组分的制备在

30

万级条件下进行。药品制造过程１.３空气净化技术

空气净化不仅要除去空气中的生物粒子，也要除去其他各种颗粒，主要靠物理作用而不是靠化学方法。空气净化技术的目的是通过采用一整套洁净技术创造和保持一定空间内空气达到规定的洁净度。

药品制造过程１.３.１整体净化：可分为层流型和湍流型。层流是指空气由一侧全面地以同速流向另一侧，使室内产生的尘粒或细菌不会向四周扩散而被平推出室外，而达到好的除菌效果。

药品制造过程（

1

）高效过滤除菌技术：空气洁净主要靠高效或超高效过滤设备（高效空气过滤器HEPA)，向特定的环境内输送洁净空气并能保持空气的洁净度。过滤洁净原理：①网截阻留；②筛孔阻留；③静电吸引阻留；④惯性碰撞和布朗运动阻留。因此，过滤洁净技术是一种综合作用的结果。药品制造过程药品制造过程药品制造过程（

2

）滤材结构：生物洁净室所用滤材级别多数为高效或超高效滤材，所用滤材有：玻璃棉制滤材、高级纸浆制滤材、石棉纤维滤材、过氯乙烯纤维滤材等。高效滤材对空气中

0.5μm的颗粒的阻留率能达到

90%~99%

，超高效滤材可阻留0.3μm的颗粒

99.9%

以上。药品制造过程1.3.2局部净化（

1

）洁净层流罩：洁净层流罩是医院局部空气净化装置。一般可构成垂直层流方式，四周用透明围幕。整个罩内可保持高洁净度（万级至百级）空气。这种洁净层流罩可用于免疫功能低下病人的治疗保护，所以也称无菌病床层流罩。（

2

）净化操作台：采用水平或垂直层流方式净化箱体内的空气，可使操作台内净化达到很高级别。药品制造过程1.4洁净室的设计

1

、洁净室设计应遵循的原则：远离或隔断污染源；控制污染源扩散或定向扩散；正确利用室内外压差；进出风量平衡。

2

、医用洁净室基本要求：高效过滤，纵向层流，双缓冲，压力递减。

药品制造过程

3

、医药行业洁净要求：外窗应双层密封；所有的连接部分均应密封；门应向洁净度高的方向开启；室内水池、地漏不得产生污染，

100

级内不得设置地漏；人、物出入应有防交叉污染措施；生产高致敏性药物、强毒微生物与芽孢菌制品的区域应相对负压，并有独立的空气净化系统。

药品制造过程1.5人员进出洁净生产区和无菌操作洁净生产区的一般程序：

(1)

人员进出洁净生产区的程序

(2)

人员进出无菌操作洁净生产区的程序

药品制造过程

（

4

）进入洁净室（区）的人员不能化妆和佩带饰物，不应裸手操作，当不可避免时，手部应及时消毒。

（

5

）洁净工作服的质地应光滑，不产生静电，不脱落纤维和颗粒性物质。无菌工作服必须包盖全部头发、胡须及脚部，并能阻留脱落物。

（

6

）药品生产人员应有健康档案。直接接触药品的生产人员每年至少体检一次。传染病、皮肤病患者和体表有伤口者不得从事直接接触药品的生产。药品制造过程1.6污染源知识

1、发尘量

发尘主要来自人，占90%左右。在人的发尘量上，由于服装材料和样式的改进，发尘绝对量也不断减少。(1)、材质：棉质发尘量最大，以下依次为棉、的确良、去静电纯涤纶、尼龙。

药品制造过程

(2)、样式：大挂式发尘量最大，上下分装型次之，全罩型最少；

(3)、活动：动作时的发尘量一般达到静止时间3-7倍；

(4)、清洗：用容剂洗涤的发尘量降至用一般水清洗的五分之一。

药品制造过程2、发菌量

（１）

洁净室内当工作人员穿无菌服时：

静止时的发菌量一般为10-300个/min.人

躯体一般活动时的发菌量为

150-1000个/min.人

快步行走时的发菌量为

900-2500个/min.人

（２）

咳嗽一次一般为

70~700个/

min.人

喷嚏一次一般为

4000~62000个/

min.人

大学便民网

药品制造过程

（３）

穿平常衣服时发菌量

3300~62000个/

min.人

（４）

无口罩发菌量:有口罩发菌量

1:7~1:14

药品制造过程2、清洁、净化、消毒清洁:去除脏物(有机、无机物)净化:灭活和去除一些不受欢迎的物质(内毒素、病毒）消毒:破坏和去除活的微生物药品制造过程2.1制造区的清洁、净化、消毒：2.2加工仪器的清洁、净化、消毒：发酵设备、层析设备（NaOH1M）药品制造过程药品制造过程３、制造用水生活用水纯净水

注射用水一次水、二次水药品制造过程注射用水：指符合中国药典注射用水项下规定的水3.1注射用水的制备注射用水可通过蒸馏法、反渗透法、超过滤器法等获得，各国对注射用水的生长方法作了十分明确的规定，如：①美国药典（24版）规定“注射用水必须由符合美国环境保护协会或欧共体或日本法定要求的饮用水经蒸馏或反渗透纯化而得”。药品制造过程②欧洲药典（1997年版）规定“注射用水为符合法定标准得饮用水或纯化水经适当方法蒸馏而得。③中国药典（2000年版）规定“本品（注射用水）为纯化水经蒸馏所得的水“。

注射用水用纯化水经蒸馏而得是世界公认的首选方法。药品制造过程药品制造过程药品制造过程３.２对贮罐的要求：①采用不锈钢制作，内壁电抛光并作钝化处理；②贮水罐上安装0.2μm疏水性的通气过滤器（呼吸器），并可以加热消毒或有夹套；③能经受至少121℃高温蒸汽的消毒；④排水阀采用不锈钢隔膜阀；⑤若充以氮气，须装0.2μm的疏水性过滤器过滤。

药品制造过程３.３对管路及分配系统的基本要求管路分配系统的建造应考虑到水在管路中能连续循环，并能定期清洁和消毒。不断循环的系统易于保持正常的运行状态。循环一般流速：９ft/s，温度：85℃。

使用前冷却至25℃。药品制造过程3.4注射用水系统的运行方式注射用水系统的运行徐考虑到管道分配系统的定期清洁和消毒，通常有两种运行方式。一种是将水像产品一样作成批号，即批量式运行方式。“批量式”运行方式主要是出于安全性的考虑，因为这种方法能在化验期内将一定量的水份隔开来，直到化验有了结论为止。另一种是连续制水的“直流式”运行方式，可以一边生产一边使用。药品制造过程3.5注射用水系统的日常管理①制水系统的操作、维修规程；②关键的水质参数和运行参数的监测计划，包括关键仪表的校准；③定期消毒／灭菌计划；④水处理设备的预防性维修计划；⑤关键水处理设备（包括主要的零部件）、管路分配系统及运行条件便更的管理方法。

药品制造过程４、文件

（１）标准操作程序（SOP）（２）制造规格（３）制造方案、工艺和包装说明（４）记录药品制造过程4.1SOP(StandardOperationProcedure):即标准作业程序,就是将某一事件的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来,用来指导和规范日常的工作。SOP的精髓,就是将细节进行量化,用更通俗的话来说,SOP就是对某一程序中的关键控制点进行细化和量化。

药品制造过程4.2SOP的作用：1.将企业积累下来的技术﹑经验,记录在标准文件中,以免因技术人员的流动而使技术流失;2.使操作人员经过短期培训,快速掌握较为先进合理的操作技术;3.根据作业标准,易于追查不良品产生之原因;4.树立良好的生产形象，取得客户信赖与满意。5.是贯彻ISO精神核心(说，写，做一致)之具体体现，实现生产管理规范化、生产流程条理化、标准化、形象化、简单化。6.是企业最基本﹑最有效的管理工具和技术数据。

药品制造过程4.3标准操作规程(SOP)的内容

1、生产操作方法和要点；2、重点操作的复核、复查；3、中间产品质量标准及控制；4、安全和劳动保护；5、设备维修、清洗；6、异常情况处理和报告；7、工艺卫生和环境卫生。

药品制造过程4.4制造方案与工艺1、品名；2、成品有效期（可附稳定性考察总结，证明有效期制订有据可查）；3、产品规格和批量；4、所用原料清单（阐明每一原料的名称、代号和用量，对加工过程中可能消失的物料应作说明）5、最终物料平衡限度；药品制造过程6、主要设备一览表及说明；7、关键设备的准备（如设备的清洗、组装、校验、灭菌等）方法；8、详细的加工步骤（如物料的核对、预处理，加入物料的顺序，混合时间，温度等）；9、中间控制方法及其合格限度；10、半成品的贮存要求，包括容器、标签及特殊贮存条件；11、必要的安全、避光等特别注意事项。药品制造过程4.5记录1、生产管理、质量管理的各项制度和记录2、厂房、设施和设备的使用、维护、保养、检修记录。3、不合格药品管理、物料退库和报废、紧急情况处理记录。4、环境、厂房、设备、人员等卫生管理记录对人员进行规范和专业技术等培训记录。药品制造过程4.6制造记录（批生产记录）3.1产品名称、生产批号、生产日期；3.2操作者、复核者的签名；3.3有关操作与设备；3.4相关生产阶段的产品数量；3.5物料平衡的计算；3.6生产过程的控制记录；3.7特殊问题记录如偏差记录、调查、评估等内容。药品制造过程第四节生物药物的来源药品制造过程

体外表达：无细胞表达系统

原核表达系统：大肠杆菌表达系统体内表达：酵母表达系统

真核表达系统

昆虫细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统

动物/植物表达系统（转基因动物/植物）

药品制造过程4.1原核表达系统(大肠杆菌)

组织纤溶酶原激活物(t-PA)、胰岛素、干扰素、粒细胞集落刺激因子、人生长激素药品制造过程1、生物药物表达体系的选择依据2、原核表达系统的优势3、原核表达系统的局限性4、选择原核表达体系的条件5、原核表达系统的应用示例药品制造过程4.1.1生物药物表达体系的选择依据1、关于药物的考虑？2、关于规模的考虑？3、关于经济的考虑？药品制造过程4.1.2原核表达系统的优势１、遗传背景清楚２、表达效率高３、发酵成本低，过程简便药品制造过程4.1.3原核表达系统的局限性1、翻译后加工修饰体系不完善2、异源蛋白质容易在细胞内积聚3、脂多糖及内毒素药品制造过程包含体（inclusionbody）：表达的外源蛋白质在细菌内与细菌杂蛋白、核酸等成分形成不溶性聚合体。尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成速度太快，多肽链相互缠绕，影响了多肽链的正确折叠，导致疏水基团外露等。药品制造过程

包含体的形成有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解，并且非常有利于分离表达产物。但包含体形成后，表达蛋白不具有生物活性，因此必须溶解包含体并对表达蛋白进行复性。药品制造过程4.1.4选择原核表达体系的条件1、蛋白质无糖基化或糖基化不影响其生物活性2、结构相对简单，无复杂的高级结构3、含有较少的二硫键药品制造过程4.1.5原核表达系统的应用示例药品制造过程常见的商业化表达系统有：1、pETsystemandpETBlue™system（Novagen公司），是原核蛋白表达中应用最多的系统。具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌。目前共有包括40多种载体、15种不同宿主菌和配套齐全的用于有效检测和纯化目标蛋白的相关产品。药品制造过程2、pBAD表达系统（Invitrogen公司），可控制蛋白质的生产水平低于其成为不溶性蛋白的域值。通过与硫氧还蛋白的融合来增加溶解度

3、QIAexpressExpressionSystem（Qiagen公司）。药品制造过程表达蛋白的部位：1、分泌表达；2、外周质及膜上表达；3、胞内表达。药品制造过程表达蛋白的形式1、融合表达2、非融合表达药品制造过程融合表达：要表达的外源基因连接在一段原核基因的下游，蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由外源DNA的完整序列编码，这样的蛋白质由1条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。药品制造过程融合的目的：①转录和翻译起始从正常的大肠杆菌序列开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白；②融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定；③有助于蛋白质的分离和纯化。药品制造过程融合方式：HisTag融合半乳糖苷酶融合trpE融合蛋白谷胱甘肽S－转移酶（GST）融合硫氧还蛋白（Trx）融合麦芽糖结合蛋白（MBP）融合碱性磷酸酶（phoA）启动子和信号序列

药品制造过程融合蛋白的裂解：1、化学裂解法：特异识别特定的氨基酸残基或一组氨基酸残基。但化学裂解法裂解位点的特异性低，有时可能对目标蛋白产生不必要修饰。药品制造过程2、酶解法：反应条件温和，具有高度的特异性。常用的酶有Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶等。但酶解法成本高，反应时间长，更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目标蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。药品制造过程3、IMPACT系统：

该系统是由枯草杆菌来源的几丁质结合域（5kD，chitinbindingdomain，用于亲和纯化）和酵母蛋白质剪接元件

intein组成一个双效的融合标签。intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解，释放出与之相连的目的蛋白。因此融合蛋白无需蛋白酶裂解即可实现目的蛋白与fusiontag的精确切割。但含有较多二硫键的蛋白不适合这一系统。

药品制造过程非融合表达：指在细菌内表达的蛋白质以真核蛋白质mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含任何细菌多肽序列。优点：表达产物的生物学功能接近于生物体内天然蛋白质，表达量高。缺点：容易被细菌蛋白酶破坏，容易形成包含体。药品制造过程4.1.6pET系统

pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。药品制造过程

该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定。药品制造过程药品制造过程药品制造过程4.2酵母表达系统胰岛素、集落刺激因子、水蛭素、尿酸氧化酶、生长因子药品制造过程4.2.1酵母表达系统的优势1、分子生物学研究透彻，易于遗传操作。2、具有很长的工业应用史。（安全）3、可以在相对便宜的培养基中生长。（经济）4、有合适的工业化发酵设备和技术可供使用。5、可以进行一定的糖基化修饰。药品制造过程4.2.2酵母表达系统的局限性1、糖基化的模式与天然糖蛋白存在差异2、表达水平较低药品制造过程4.2.3酵母表达系统载体：均为大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。有附加体型载体和整合体型载体两种。1、整合型载体:导入酵母宿主细胞后与酵母细胞染色体基因组DNA整合，稳定性高，但基因拷贝数低。

2、附加体型载体：在酵母宿主中拷贝数量大，但在传代过程中易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量。药品制造过程

常见宿主有：酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、巴氏毕赤酵母等。

药品制造过程

酿酒酵母表达系统多为附加型载体，巴氏毕赤酵母表达系统为整合型载体。酿酒酵母表达系统缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达质粒易于丢失。目前，毕赤酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统。它以甲醇作为唯一的碳源。产量较高。翻译后的加工更接近哺乳动物。如日本绿十字公司利用该系统可以达到公斤级水平的人血清白蛋白的生产。药品制造过程

商品化酵母表达系统有毕赤酵母（Pichia）系统（invitrogen）和Saccharomyces酿酒酵母表达系统（invitrogen）。毕赤酵母系统重组蛋白表达量可高达12g/L，表达量最高。药品制造过程

4.3昆虫细胞表达系统

昆虫细胞表达系统是以杆状病毒为载体，昆虫细胞为宿主的表达系统。

药品制造过程4.3.1昆虫细胞表达系统的优势1、表达效率高。重组蛋白的表达水平最高可达到细胞总蛋白的50％。2、属于真核表达系统。有糖基化作用、脂肪酸酰基化作用、氨基末端乙酰化作用以及磷酸化，有利于表达产物形成天然的高级结构，保持原有的生物活性与功能。3、杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖。药品制造过程4、杆状病毒属于昆虫病毒。具有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性。病毒重组因失去多角体保护，在自然界的生存能力很弱，因此比较安全。5、杆状病毒表达载体通用性广。可表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因。

6、重组杆状病毒除在体外昆虫培养细胞表达外源基因外，还能感染昆虫活体，在体内高效表达外源蛋白。药品制造过程4.3.2昆虫细胞表达系统的局限性1、宿主细胞生长慢、培养基昂贵。2、含有免疫宿主蛋白、杆状病毒感染会导致宿主死亡、因此每一轮蛋白合成均需重新感染。3、昆虫细胞内的糖基化方式与脊椎动物细胞内的糖基化方式有一定的差异，其糖蛋白的糖链结构多为简单的不分支结构。

药品制造过程

4.3.2昆虫细胞表达系统的局限性启动子采用多角体蛋白启动子。宿主细胞通常来源于双翅目昆虫，包括果蝇、蚊子。来源于草地夜蛾（Spodopterafrugiperda）的Sf9细胞系是最常用的宿主细胞。药品制造过程商品化系统：

BaculoDirect™杆状病毒表达系统（invitrogen），典型的杆状病毒表达系统是利用大肠杆菌中位点特异的转座或昆虫细胞中的同源重组来产生重组杆状病毒。

DES®-Drosophilaexpressionsystem结合了昆虫细胞高表达水平和哺乳动物细胞的稳定表达的优点。药品制造过程

4.4哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统是生产天然蛋白的理想表达系统，是目前应用最广泛的动物细胞表达系统。其优点和缺点都极其显著。产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最精确。一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。药品制造过程

但该表达系统的表达水平较低、培养基昂贵、生长缓慢、含有过敏物质等缺点在实际应用过程中较难避免。哺乳动物细胞表达系统通常用来生产用常规方法无法获得的真核细胞蛋白。如EPO，TNF受体，基因工程单抗等。

CHO（中国仓鼠卵巢）是目前重组糖蛋白生产的首选体系。药品制造过程哺乳动物细胞表达系统载体：1、病毒性载体系统，包括逆转录病毒载体及其它DNA病毒载体。优点：能够高效导入外源基因。缺点：包装时对其基因组的长度有严格的限制，插入外源基因一般较短。2、质粒性载体系统。优点：适用于多种细胞；安全。缺点：导入外源基因的效率不如逆转录病毒。

药品制造过程商品化系统：ViraPower™慢病毒表达系统，是第一次实现在不分裂的哺乳动物细胞中进行稳定的高水平基因表达。Adeno-X™表达系统－最有效的腺病毒系统之一。BDAdeno-X™ExpressionSystem(Clontech)可以在2周内获得高效价的腺病毒，其效率远高于其他腺病毒系统。BDAdeno-X™Tet-On™&Adeno-X™Tet-Off™

ExpressionSystems(Clontech)

可表达毒性蛋白质。BDRevTet-On™&RevTet-Off™GeneExpressionSystems(Clontech)

表达效率高。药品制造过程4.5转基因动物表达体系优势：

1、原产物易于收集2、卫生意识3、低投入、低成本4、高水平表达5、连续不断的产品供应6、有利于下游加工工艺的建立药品制造过程

缺点：1、表达水平不确定性2、糖基化问题3、滞后现象药品制造过程4.6转基因植物表达体系优势：1、培养费用低2、收获设备或方法费用不贵，并且成熟3、易于放大4、表达蛋白稳定，可保存较长时间5、没有人类病原体药品制造过程

缺点：1、表达不稳定或水平较低。2、基因沉默现象。3、糖基化模式问题。4、植物生长存在季节性和地域性。药品制造过程第五节终产品的制造药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程5.1细胞库系统（菌种库系统）筛选、保存、复苏、复壮、细胞库药品制造过程5.1.1菌种的筛选药品制造过程几种菌落药品制造过程5.1.2菌种的保藏

菌连续在培养基上（内）移种种生活态传代培养保藏法连续在活宿主上（内）移种保固体斜面藏湿法半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管内吸附在合适的载体上药品制造过程1、湿法保藏菌种的方法①低温保藏法：

方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代。

原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。②石蜡油低温保藏法：

橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。

药品制造过程③真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。④液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196℃）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。药品制造过程2、干法保藏菌种的方法

滴入小试管（在放入大试管干燥器中）藏在玻璃管内封入安培瓶菌液直接真空干燥法（L-干燥法）冷冻真空干燥法细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒）球块状载体（硅胶、瓷球）合适的载体有机基质（曲料、麦粒）滤纸片薄片状载体明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）血清蛋白小片（…乙烯薄膜…

）药品制造过程

3、几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类**产孢子微生物各大类3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上简便简便简便简便有效简便有效药品制造过程5.1.3菌种的复苏药品制造过程5.1.5细胞库（菌种库）主细胞库、1号工作细胞库药品制造过程1、细胞库系统2、上游过程3、微生物细胞发酵4、动物细胞培养5、下游工艺6、成品配方药品制造过程7、保持蛋白质活性（影响因素、降解、脱酰胺作用、氧化、二硫键转换、糖基化8、终产品加入稳定剂9、终产品灌装10、冷冻干燥11、包装药品制造过程

5.2上游过程

摇瓶保藏菌种试管斜面活化茄瓶斜面种子罐固体培养基药品制造过程药品制造过程摇瓶种子培养发酵培养药品制造过程药品制造过程药品制造过程5.3微生物细胞发酵5.4动物细胞培养药品制造过程5.5下游工艺下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。

药品制造过程药品制造过程5.5.1纯化工艺常用衔接技术1、盐析。（硫酸铵、硫酸钠）2、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。3、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分级沉淀。4、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。药品制造过程5、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量的超滤膜进行超滤。6、真空冷冻干燥。利用在低温和高真空条件下，冰不经融化为液态水而直接升华为水蒸气的原理。可以很好地浓缩样品和保存蛋白质、多肽的生物活性。7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。例如胸腺肽制备中使用的热变性(~80℃)去除杂蛋白。如果目的蛋白、多肽本身热稳定性、酸碱稳定性不高则不宜采用。药品制造过程8、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采用高速冷冻离心机进行。9、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，SephadexG25、G50常用于蛋白质脱盐。10、过滤。澄清过滤、除菌过滤（0.22微米膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）药品制造过程５.５.２纯化前的准备工作（1）样品稳定性试验

a、测定样品在pH2-9的稳定性；

b、测定样品在0-4mol/LNaCl及0-2mol/L硫酸铵中的稳定性；

c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；

d、测定样品在4-40℃的稳定性；

e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。药品制造过程2）样品预处理

a、去除样品中颗粒物（0.45-0.22微米膜过滤或者10000g离心15分钟）

b、去除样品中脂类（10000g离心15分钟或有机溶剂抽提）

c、去除样品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）

d、抑制样品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制剂）药品制造过程（3）样品的保存条件：

短期储存（小于24小时）

a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀

b、在密闭容器中冰箱冷藏

较长期储存（数天）

a、b、同上

c、加入适当的抑菌剂

长期储存

a、同上

b、冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。

药品制造过程５.５.３对纯化步骤的评价相关方法的建立

a、目的蛋白含量测定

酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。

b、总蛋白含量测定

紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法（考马斯亮兰G-250）等。

c、样品复杂度检测

HPLC（离子交换、凝胶过滤、反相）、SDS、等电聚焦、毛细管电泳（CE）

药品制造过程５.５.４蛋白质的来源

（1）天然蛋白：天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多个步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。

（2）重组蛋白：重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。药品制造过程５.５.５重组蛋白主要有三种表达定位：a、细胞质：在这种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体b、外周质：表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。药品制造过程５.５.６常用液相色谱纯化方法

药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程药品制造过程1、凝胶过滤（分子筛、大小排阻色谱、凝胶渗入色谱）。

根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量（Stroke半径）较大的先出峰，分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为SephadexG系列药品制造过程药品制造过程药品制造过程目前常用的凝胶包括3个主要类型：1.Polydextran（交联葡聚糖凝胶）

Polydextran的商品名称是Sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型号，如G-25、G-75、G-100或是G-200，G后面的数字为凝胶吸水量再乘以10，以G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5ml。药品制造过程

2.

Polyacrylamide（聚丙烯酰胺凝胶）

Polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-GelP，干粉颗粒状，在溶剂中自动溶成胶体，依胶的分离范围不同，分成Bio-GelP-2至Bio-GelP-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。

Polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的pH下会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH值应尽量控制在2-10之间。药品制造过程3.

Agarose（琼脂糖凝胶）商品名Sepharose，属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose2B，4B和6B。

Agarosegel是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。Agarose做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。药品制造过程

凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细的分离效果好，但流速慢而费时，因此要依据实际的需要来选择。对于分子量较小的物质，一般采用polydextran或polyacrylamide材质的凝胶，大分子物质则使用agarose。

以Sephadex为例，SephadexG-50可用于区分分子量1,500~30,000之分子，而SephadexG-75凝胶可区分分子量3,000~70,000之分子，所以若要分离分子量10,000及20,000之分子，两种都适用。药品制造过程

如果要分离的分子大小相差很多，则可选用柱高：直径＝5：1~15：1的管柱，且管柱体积要大于4~15倍的样品体积；如果要分离的物质之间分子量差异不大，则要选用柱高：直径＝20：1~100：1的管柱，且管柱体积要大于25~100倍的样品体积。药品制造过程

将凝胶装入管柱的方法有很多种，常用的方法是先在柱中加入约1/3体积的冲洗液，边轻轻搅伴边将凝胶悬浮液倒入其中，等到底部沉积约1~2公分的凝胶后，打开下方出口让水流出，上面不断加入悬浮液，等到沉积到离顶部约3~5公分处停止，让3~5倍柱床体积的缓冲液流过层析柱。药品制造过程

冲洗缓冲液仅需留高于柱床2公分左右，多余的可用滴管吸去，再将出口打开使冲洗液流到距表面1~2公厘，关闭出口，用滴管缓缓加入样品再打开出口，样品完全渗入凝胶内后，加入约4公分冲洗液，出口处接上收集瓶开始层析。药品制造过程

由于polydextran和agarose都属于多醣类，一旦微生物生长过多，分泌的酶会水解凝胶使其性质改变，为了防止这种情况发生，凝胶最好采用真空或低温保存，但温度不能过低使凝胶冻结。加入抑菌剂（也是常用的方法。长时间不用的凝胶可用干燥保存法，也就是把使用过的凝胶用水除去碎颗粒和杂质，再用不同浓度的酒精，由70%、90%到95%逐步脱水，在摄氏60~80度下烘干，不能加热的Sepharose则用乙醚洗涤干燥。药品制造过程2、离子交换色谱

由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。

药品制造过程两种模式：一种使目的蛋白结合凝胶，通过梯度洗脱；一种使目的蛋白不结合凝胶，而大部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有目的蛋白。

药品制造过程

最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene），它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯（divinylbenzene）聚合产生的三维网状结构。药品制造过程

除了树脂以外，纤维素、葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶也是常用的离子交换材质，特性是具有亲水性和较大的表面积，对生物活性物质而言，