人类疾病动物模型和免疫缺陷动物

人类疾病动物模型

免疫缺陷动物第一节人类疾病动物模型定义和意义第二节人类疾病动物模型的分类第三节免疫缺陷动物模型第四节转基因动物模型第一节：人类疾病动物模型定义人类疾病动物模型(Animalmodelsforhumandiseases)是指在生物医药研究中，在动物身上建立或形成的类似人类疾病的动物。通过动物模型直接或间接反映疾病的发生和发展过程，在了解疾病的基础上开创、改进和优化疾病的治疗。本质上利用各种动物的生物学特性和疾病的特点，与人类疾病进行比较研究，避免了以人类本身作为直接研究对象。用人类本身作为直接的研究对象，在时间和空间以及方法上都有局限性，还存在伦理道德以及法律上的限制，限制了医学和生命科学的发展，而动物模型的使用则克服了这种限制。人类疾病动物模型的意义1.避免直接实验所造成危险。2.临床上平时不易见的疾病可以随时复制。3.增加方法学上的可比性。4.样品易得，实验方法简化。5.有助于了解疾病的本质。1.避免直接实验所造成危险。神农尝白草肿瘤损伤中毒辐射2.临床上平时不易见的疾病可以随时复制发病率低：遗传疾病，传染病，内分泌疾病，肿瘤潜伏期长：动脉粥样硬化，高血压病程长：慢性哮喘，甲亢放射病，毒气中毒，烈性传染病3.增加方法学上的可比性年龄，性别，体质，遗传，社会因素等，都对疾病发生发展起着一定的影响作用。动物模型，人为设计，遗传背景等各项条件都很清楚，或可以控制，因此可以排除外因干扰，所获结果更可靠。4.样品易得，实验方法简化动物模型，可按需要采集各种样品，其中包括处死收集标本。取材方便，简化了试验方法。5.有助于了解疾病的本质临床研究带有一定的局限性人和动物均感染的疾病,AIDS,SARS等观察遗传因素对疾病发生发展的影响可以用单一病因短时间复制出人类疾病动物疾病模型应具有以下特点①应再现所要研究的人类疾病，动物疾病表现应与人类疾病相类似；②动物能重复产生该疾病，最好能在2种动物体上复制该病；③实验动物合格，动物背景资料完整，生命周期要满足实验需要；④动物要价廉、来源充足、便于运送；⑤尽可能选用体型小的动物。第二节：人类疾病动物模型的分类一.医学动物模型基本分类（产生原因）1．诱发性动物疾病模型(ExperimentalorInducedanimalmodel)

是指以物理学、化学、生物学等致病手段，人为导致动物组织、器官或整体出现一定程度的损伤,使其在功能、代谢、形态结构等方面出现类似人类疾病的病变，即人为地诱发动物产生类似人类疾病的模型。应用：药理学，毒理学，免疫学，肿瘤学和传染病等优点：简便，条件简单，其他因素容易控制，短时间内可大量复制不足：诱发动物模型在某些方面与自然产生的疾病模型有所不同；某些疾病不能用人工方法诱导。

2．自发性动物模型(Spontaneousanimalmodel)

是指不加任何人工诱发，在自然条件下动物自然产生的疾病，或者由于基因突变的异常表现，通过遗传育种保留下来的动物疾病模型。其中包括近交系的肿瘤疾病模型和突变系的遗传性疾病模型。

常用的自发突变模型高血压模型（SHR大鼠）肥胖模型（Zucker大鼠）糖尿病模型GK大鼠：非肥胖2型糖尿病、轻度高血糖、胰岛素抗性、高胰岛素血症肥胖并糖尿病模型db/db小鼠：Ⅱ型糖尿病模型优点：在一定程度上减少人为的因素，更接近自然的人类疾病。缺点：目前发现的种类有限。近交系肿瘤模型，因实验动物种属，品系不同，其肿瘤发生类型，机理有所不同疾病动物需要饲养条件要求高，操作技术性强。3．抗疾病型动物模型(Negativeanimalmodel)

是指特定的疾病不会在某种动物身上发生。因此，可借以探讨为什么该动物对这种特定疾病有天然的抵抗力。哺乳类易感染血吸虫病,而东方田鼠不感染,可用于血吸虫感染和抗病研究。4．生物医学动物模型(Biomedicalanimalmodel)

是指以正常实验动物生物学特征，提供人类疾病相似表现的疾病模型。鹿---红细胞镰刀形---人的贫血

二、按系统范围分类1．疾病基本病理过程动物模型

是指致病因素在一定条件下作用于动物后，所出现的共同性的功能、代谢和形态结构某些改变的动物模型。这种动物模型的致病因素不是某种疾病所特有的，而是各种疾病都可能共同发生的。是研究疾病机理和药物筛选理想的方法。2．各系统疾病动物模型

是指与人类各系统疾病相应的动物模型，如神经、心血管、呼吸、消化、泌尿等系统疾病相应的动物模型。[A.神经系统]1．大鼠囊状脑动脉瘤结扎大鼠颈总动脉，同时佐以脱氧皮质酮和高渗盐水处理，饲喂含有β氨基丙氰的饲料，复制囊状动脉瘤模型，为研究人类脑动脉瘤与血液动力学的关系，病变的发展及发病机理提供有益的帮助。

[A.神经系统]2．结扎大鼠中动脉的大鼠卒中模型结扎大鼠大脑中动脉，复制中风模型。其优点是能产生非致命性的孤立性病灶损害，可提供长期的行为学和生物化学的研究。[A.神经系统]3.维生素A缺乏引起的兔脑积水模型选用雌性幼兔，饲以限制维生素A饲料，诱发兔脑积水。该模型优点是易复制，易收集胎兔和新生兔的标本样品，通过血清维生素A的监测，可控制血清中维生素A的浓度，有利进行生化和形态学的研究。[B.心血管系统]1.动脉粥样硬化长期以来饲以高脂肪、高胆固醇饲料诱发动脉粥样硬化的动物模型。给小型猪饲喂高脂肪、高胆固醇饲料诱发动脉粥样硬化病变，其解剖部位，病理特点均与人类相似，有时还伴有心肌梗塞，较易饲养管理，小型猪是一种很好的模型动物。

[B.心血管系统]2．心肌缺血和心肌梗塞①电刺激法：雄性成年兔麻醉后，用弱、强电流交替刺激右侧下丘脑背侧核，复制心肌缺血动物模型；②药物法：给大鼠、兔注射异丙肾上腺素，犬静脉给予麦角新硷制备冠状动脉痉挛模型；③冠状动脉阻断法：大鼠、犬麻醉后,分离冠状动脉套上自制的冠状动脉压迫环，制备心肌缺血和心肌梗死模型。

[B.心血管系统]3．高血压

目前，应用最广泛的是日本学者培育的突变系SHR大鼠。该鼠自发性高血压的变化与人类相似，并且可产生脑血栓、梗塞、出血、肾硬化、心肌梗死和纤维化等变化。在SHR的基础上，又培育了两个亚系SHRSP和SHRSR，前者出生后，除出现严重高血压外,90％以上患脑卒中(脑出血和脑栓塞)；SHRSR则是抗脑卒中的自发性高血压大鼠。[C.呼吸系统]

1．支气管哮喘模型：用异性蛋白注射致豚鼠过敏，包括支气管痉挛、哮喘和过敏性休克。1974年发现狗可以对空气中过敏原(草、树、灰尘和猫抗原)引起过敏症的模型。主要表现为患犬出现眼结膜炎、鼻炎、重度搔痒性皮炎，血液内有抗脉草抗原的循环抗体，相当于人体免疫球蛋白IgE。[C.呼吸系统]

2．慢性支气管炎和肺炎应用SO2、烟雾、甲醛蒸气、辣性气体等制备诱发性猴、兔、大鼠、小鼠的慢性支气管炎动物模型。有人先后将木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白溶解酶分别注入兔，大鼠，地鼠气管内诱发肺气肿。[D.消化系统]1．肝硬化模型：实验动物皮下、肌肉或腹腔注射CCl4制成实验性肝硬化模型。用缺乏胆碱的低蛋白高脂肪饲料饲喂幼大鼠，可制成胆碱缺乏性肝硬化模型。[D.消化系统]2．小牛轮状病毒性肠炎模型：轮状病毒性肠炎对人类及许多动物都能引起感染，如小鼠、兔、羊、猪等。在实验中发现人类与动物可交叉感染，小牛轮状病毒性模型有利于生产大量血清与抗原，便于手术、粪便特征容易监测，是传染病学、生理学研究较好模型。

[D.消化系统]3．豚鼠溃疡性结肠炎模型：豚鼠口服变质角叉菜(从红海藻中提取)溶液，产生溃疡性结肠炎、临床表现与人类溃疡性结肠炎相似，是研究溃疡性的发病机理、综合症对全身影响和治疗方法的模型。[E.泌尿系统]1.诱发性肾小球肾炎模型：给兔、猫、狗注射异种抗肾血清、细菌抗原与肾组织复合抗原，以及抗原抗体诱发动物肾小球肾炎模型。[E.泌尿系统]2.自发性肾脏疾患模型：如芬兰的Landrace羊羔中有一种发展迅速致死的肾小球肾炎，伴有肾小球免疫荧光复合物的沉积。狗、猫自发的免疫介导肾小球肾炎动物模型。

[E.泌尿系统]3.继发性肾炎模型：小鼠淋巴脉络膜炎、乳酸脱氢酶、鼠类的白血病病毒感染等均能复制继发性肾炎。[F.内分泌与代谢](1)手术糖尿病模型：

自从德国的WonMening将犬作胰腺全切除术，造成糖尿病后，陆续报道猫、大鼠、兔、猪、猴等切除80％一90％胰腺，并受到高糖饮食刺激后，引起永久性糖尿病。[F.内分泌与代谢](2)化学物质损伤胰岛细胞：①链脲佐菌素(STZ)一次腹腔或静脉注射30一100mg／kg几天后可使狗、大鼠等动物产生永久性高血糖。②环丙庚哌,给大鼠连续给药4周后，可见高血糖症状。③鼠脑炎、心肌炎(EMC)病毒M型变异可诱发若干品系的成年小鼠糖尿病，如DBA／2、CD-l、C3H、C57BL、BALB／cj。

[F.内分泌与代谢](3)遗传性及自发性糖尿病：①kk小鼠由日本杂种小鼠交配得来的遗传性糖尿病小鼠，其生物特性类似ob小鼠，属先天遗传缺陷性小鼠。②C57BL／ks小鼠是一种具有db基因的近交小鼠，其表现多食肥胖及血糖升高，类似人类中年肥胖合并糖尿病③中国地鼠(黑线仓鼠)有50％自发产生糖尿病，属多基因遗传，病鼠耐糖曲线类似人类Ⅱ型非胰岛素依赖性)糖尿病。④BBWistar系大鼠：是一种典型自发遗传I型(胰岛素依赖性)糖尿病的动物模型。其临床表现为多饮、多食、体重下降、高血糖及酮尿。三、中医证候动物模型中医动物模型经30余年的研究，已形成独特的体系。为中医基础病理学、基础药理学研究提供了重要依据。1960年发现过量使用肾上腺皮质激素的小鼠表现为阳虚征象：体重下降、萎靡、耐寒力低。1963年又发现用助阳药(附子、肉桂、淡众蓉、仙灵脾)能治疗这种状态。1964年，易宁育用六味地黄汤治疗类似阴虚的肾性高血压大鼠。1977年，上海中医学院用肾上腺皮质激素和甲状腺，加利血平复制小鼠阳虚、阴虚模型并用助阳药、滋阴药治疗。1979年，张启元尝试用灌喂大黄煎剂“泻下伤脾”，建立小鼠脾虚证模型。1988年，由杨云主持研究的“劳倦和饥饱所致大鼠脾虚证模型”获得国家中医药管理局科技进步二等奖。

四、设计动物模型的注意事项1．尽可能再现所要的人类疾病的模型。复制模型时必须强调从研究目的出发，熟悉诱发条件、宿主特征、疾病表现和发病机制，充分了解所需动物模型的全部信息，分析能否得到预期结果。要避免选用与人类对应器官相似性很小的动物作为疾病模型2．注意选用标准化和实用价值高的动物。模型应适用于多数研究者使用，容易复制，实验中便于操作和采集各种标本。动物来源必须充足，选用多胎分娩的动物对扩大样本和重复实验是有益的。尤其对慢性疾病模型来说，动物须有一定的生存期，便于长期观察使用，以免模型完成时动物已频于死亡或毙于并发症。野生动物在自然环境中观察有助于正确评价自然发病率和死亡率。复制模型时必须注意动物种群的选择，要了解各类动物种群的特点和对复制动物的影响。３．注意环境因素对模型动物的影响复制模型的成败往往与环境的改变有密切关系。拥挤、饮食改变、过度光照、噪音、屏障系统的破坏等，任何一项被忽视都可能给模型动物带来严重影响。除此以外，复制过程中固定、出血、麻醉、手术、药物和并发症等处理不当，同样会产生难以估量的恶果。因此，要求尽可能使模型动物处于最小的变动和最少的干扰之中。４．不能盲目地使用近交系动物，不然会导致不能控制的因素进入实验

例如自发性糖尿病大鼠(BB、Wistar)除具有糖尿病临床特征外，还发现多种病理变化（外周神经系统严重病变、睾丸萎缩、甲状腺炎、胃溃疡、恶性淋巴瘤等）。因此要有目的地选择。半个世纪以来，近交系的开发不断提供着新的动物模型材料，大、小鼠疾病作为模型在医学使用量已高达70～90%。利用近交系作动物模型时还必须认识到：

1.动物形成亚系后不应该再视为同一品系。要充分了解新品系的特征和背景材料。

2.即使作为已形成模型的品系，由于不适当的育种方法和环境改变，还可发生新的基因突变和遗传漂变；即存在着变种甚至断种的危险。

3．国外经常取用二种近交系的杂交一代（F1）作为模型。其个体之间均一性好，对实验的耐受性强，又多少克服了近交系的缺点。但盲目引进F1代动物对复制所要求的模型是缺乏意义的。５．动物进化的高级程度并不意味着所有器官和功能接近于人的程度

复制动物模型时，在条件允许的情况下，应尽量考虑选用与人相似、进化程度高的动物作模型。但不能因此就认为进化程度越高等的动物其所有器官和功能越接近于人。例如，非人灵长类诱发动脉粥样硬化时，病变部位经常在小动脉、即使出现在大动脉也与人类分布不同。据报导用鸽（WhiteGameauPigeon）作这类模型时，胸主动脉出现的黄斑面积可达10%，镜下变化与人也比较相似，因此也广泛被研究者使用。６．正确地评估动物疾病模型

应该懂得没有一种动物模型能完全复制人类疾病真实情况，动物毕竟不是人体的缩影。模型实验只是一种间接性研究，只可能在一个局部或几个方面与人类疾病相似。因此，模型实验结论的正确性只是相对的，最终必须在人体身上得到验证。复制过程中一旦出现与人类疾病不同的情况，必须分析其分岐范围和程度，找到相平行的共同点，正确评估哪些是有价值的。第三节：免疫缺陷动物模型

免疫缺陷动物(ImmunodedficienctAnimal)是指由于先天性遗传突变或用人工方法，培育一种或多种免疫功能缺陷的动物。免疫缺陷动物开创了肿瘤学、免疫学、细胞生物学的新的里程碑。分类：按免疫功能缺陷的种类常分为:1.T-淋巴细胞功能缺陷动物：裸小鼠、裸大鼠、裸豚鼠等。2.B-淋巴细胞功能缺陷动物：CBA/N小鼠、Arabin马和Quarter马等马属动物。3.NK细胞功能缺陷动物：Beige小鼠。4.联合免疫缺陷动物：Scid小鼠等其他人工定向培育的多种免疫功能缺陷动物。常见的免疫缺陷动物1.裸小鼠（nudemice）先天性无胸腺，且无被毛的小鼠,简称为裸小鼠。其突变基因为裸基因,符号为:nu,是一个隐性突变基因,位于小鼠的第11号染色体上。目前，此基因已导入到不同品系的小鼠中,常见的有BALB/c-nu、C3H-nu、C57BL/6-nu等。裸鼠的解剖生理特点：

①毛囊发育不良，外观上看几乎没有被毛，故称“裸鼠”；②无胸腺，仅有胸腺残迹或异常的胸腺上皮。故不能分泌胸腺素，不能使T细胞正常分化，而T细胞是移植排异的主要细胞。Ｂ细胞基本正常但功能欠佳。有较高的NK细胞数量和活性。③因为IgG的产生需要T细胞和巨噬细胞的参与，其免疫球蛋白主要是IgM，只有极少量的IgG。④自发肿瘤现象罕见，可能与NK细胞的活性高有关。⑤裸鼠易患鼠肝炎和病毒性肺炎。⑥纯合裸鼠母性极差，且受孕率低，乳房发育不良。通常以纯合雄鼠与带有nu基因的杂合雌鼠（♀nu/+

♂nu/nu）交配可获1/2裸鼠。⑦裸鼠需饲养在屏障环境中。裸鼠的应用

（1）肿瘤学。（2）微生物学：病毒、衣原体和麻风杆菌模型。（3）免疫学：不排斥杂交瘤，生产抗体大于有胸腺小鼠。（4）寄生虫学：体内接种寄生虫制成感染模型。（5）遗传学：研究人类各种免疫缺陷性疾病的发病机理和遗传规律的重要模型。（6）临床医学：2.裸大鼠

1953年，英国科学家首次在大鼠中发现一种外观与裸小鼠相似，只是被毛不像裸小鼠那样全无，通过解剖和免疫学检查发现其也是无胸腺、缺乏T细胞功能，B细胞功能正常，NK细胞活力增强，繁殖方式与裸小鼠相同，且能接受异种组织和细胞移植。幼年的裸大鼠其免疫缺陷较成年更明显（与小鼠不同）。3.Beige（bg）小鼠

为NK细胞活性缺陷的突变系小鼠，bg是隐性突变基因，位于第13号染色体上。纯合的小鼠（bg/bg）被毛完整，但毛色变浅，耳廓和尾尖色素很淡。这种小鼠其内源性NK细胞功能缺陷。纯合bg基因降低杀菌活性。bg对化脓性细菌感染非常敏感，对各种病原因子也都较敏感，bg小鼠必须在屏障环境中才能较好的生存。繁殖时可采用纯合子的亲本。4.SCID小鼠

SCID小鼠的全称为“重症联合免疫缺陷”小鼠。其突变点在16号染色体上，为单基因突变，突变符号为scid，当其纯合时，性状表现为淋巴细胞抗原受体基因编码顺序异常，造成T、B淋巴细胞不能分化为特异性的淋巴细胞，目前已有多种不同品系的SCID小鼠。

SCID小鼠的生物学特征：

外观与普通小鼠无异样，但其胸腺、脾、淋巴结等免疫器官的重量不到正常小鼠的30%。其胸腺多为脂肪组织包围，没有皮质结构，仅残存的髓质。外周白细胞较少，淋巴细胞仅占总数的10-20%（正常小鼠为70%）。饲养环境

SCID小鼠需在屏障环境中，方能存活一年以上。其繁殖生产，以近交系繁殖方式进行，产子率和离乳率均低于正常小鼠。5.伴性免疫缺陷小鼠（X-linedimmunedeficiencymouse，XID）CBA近交系小鼠B细胞功能缺陷，其基因符号xid，位于X性染色体。纯合雌鼠和杂合雄鼠对非胸腺依赖性II型抗原没有体液免疫反应。该小鼠是研究B淋巴细胞发生、功能与异质性的理想动物模型。6.Motheaten小鼠

突变基因（me）位于第6号染色体上，出生后两天内即可有病变现象，表现为皮肤脓肿，有严重的联合免疫缺陷现象。对胸腺依赖和不依赖抗原均无反应，自然杀伤细胞活性低下。纯合鼠伴有自身免疫倾向，此小鼠对于先天性早期免疫缺陷和某些自身免疫疾病的研究有着重要的价值。7.人工定向培育的多联免疫缺陷型小鼠

目前，常见的三种小鼠的三个隐性免疫基因，即NK细胞缺陷的Beige基因、T细胞缺陷的nu基因和B细胞缺陷的Xid基因。可将它们杂交-回交，筛选出T、B、NK细胞三联免疫缺陷小鼠。这种小鼠对于实验性的肿瘤移植和免疫功能的研究有着极其重要的作用。

NOD/SCID(non-obesediabetes—SCIDmice)是在SCID小鼠的基础上与非肥胖性糖尿病小鼠(NOD/Lt)品系回交的免疫缺陷鼠。具有T、B淋巴细胞联合免疫缺陷、NK细胞活性低下、无循环补体、巨噬细胞和抗原呈递细胞（APC）功能损害等特性，近年已成为人类肿瘤移植瘤的最佳研究模型。SCID-Beige该品系为scid和beige常染色体隐性突变同类系(congenic)小鼠该品系B、T淋巴细胞功能缺失，同时自然杀伤细胞(NK细胞)功能低下特性和用途：该突变基因小鼠血清中缺乏免疫球蛋白其细胞在活体外对测试B或T细胞功能的免疫学实验不发生反应在组织病理反面表现为淋巴组织重度淋巴细胞减少广泛应用于人类生理学、病理学、免疫学和血液病学等方面的研究能接受人体正常组织的移植而成为一种嵌合体小鼠（即SCID-hu模型）进行人体免疫功能重建和肿瘤学方面的研究转基因动物的概念

所谓转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用胚胎移植技术使其在雌性动物的子宫内生长,使之发育成表达目的基因的动物,并能传给下一代，这样的动物称为转基因动物。转基因动物的应用1在遗传研究中的应用：治疗遗传病或产生某种疾病用以研究发病机理。2在肿瘤学研究中的应用：研究原癌基因的激活、抑制的调控机理，抗肿瘤药物筛选等。3在免疫学研究中的应用：用转基因小鼠模型研究免疫球蛋白的表达、免疫球蛋白的多样性以及T、B、NK细胞作用等，还为研究I和II类主要组织相容性抗原的功能提供了新的手段。4在培养动物新品种中的应用：遗传信息在同种或亲缘很近才能发生交换，大部分是通过突变来选择的。5在基因治疗研究中的应用：校正遗传疾病，但转入的基因的整合位点以及整合后将改变人类的基因库，存在伦理和技术上的难题。6生物反应器：转基因技术是瓶颈，产生的转基因动物效率低，目的基因的表达低。转基因动物技术的主要步骤获取外源目的基因外源目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物目的基因的制备

目的基因：是指准备导入受体细胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因称目的基因。

目前获得目的基因有4条途径：1.从生物基因组群体中分离目的基因

原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因。真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。

2.人工合成目的基因DNA片段

人工合成目的基因DNA片段有化学合成和酶促合成法两条途径。一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段。3.PCR反应合成DNA

聚合酶链式反应（PCR)是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计的。通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。

4.mRNA差异显示法(mRNAdifferentialdisplay,DD)获得目的基因

原理是先用PCR技术扩增所有的mRNA、生成cDNA群体，再用测序凝胶电泳获取所需要的目的基因，然后再次用PCR扩增。简单的讲，就是从基因的转录产物mRNA来反转录成cDNA作为目的基因。5、用机械的方法，例如超声波把基因组打成片段。目的基因的扩增

通过载体在宿主中克隆通过PCR扩增目的基因目的基因的导入○

脂质体介导法

·脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状结构

·形成囊状结构可将DNA包在其中

·带有外源DNA的脂质体通过细胞的内吞作用进入受体细胞，达到基因转移的目的○血影细胞介导法

·血影细胞：哺乳动物细胞溶血，使血红蛋白大量逸出，最后成为仅有被细胞膜包被的细胞核结构

·血红蛋白大量逸出时，外源DNA也容易进入。让血影细胞与受体细胞在适当条件下发生细胞融合，从而使外源DNA导入受体细胞○电转移法

受体细胞与外源DNA按一定比例混合后，放入电脉冲槽中，经用脉冲电压刺激，外源DNA即可进入细胞（或受精卵）目前应用于生产转基因动物的方法

-原核显微注射生殖细胞载体法反转录病毒转染体细胞核移植胚胎干细胞技术应用较早并且被公认和成熟的技术最具应用潜力的并且也是目前发展最快的技术原核注射

显微注射法是最早建立的转基因方法，也是目前使用最为广泛、最为有效的方法。其优点是:基因的转移率高，整合效率可达30%:可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移;外源基因的长度不受限制，可达几百kb;常常能得到纯系动物;实验周期相对比较短。外源基因基因微注射移植受精卵小鼠出生转基因鼠的检测繁殖后代A:准备注射的原核清晰的卵母细胞B:注射过程C:注射后的卵母细胞D:吸取基因注射液转GFP绿色荧光胚胎转GFP绿色荧光胚胎生殖细胞载体技术有体外和体内转染生殖细胞的两种方法，前者又包括精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注射法等。

精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。

此法理论上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不稳定，有待继续探索、完善。

逆转录病毒转染将目的基因重组到逆转录病毒RNA载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前或着床后的胚胎,也可以让胚胎与能释放逆转录病毒的单培养层细胞共孵育以达到感染的目的。逆转录病毒RNA进入寄主细胞后,被反转录为DNA,并在整合酶和其末端特殊核酸序列作用下整合到寄主细胞的基因组进行表达和遗传,得到转基因动物。目的基因逆转录病毒

卵母细胞成熟卵母细胞精子导入感染体外受精

囊胚受体动物子宫

胚胎移植转基因动物妊娠体细胞核移植体细胞核移植技术是先把外源基因整合到供体细胞上,然后将供体细胞通过显微操作的方法注射到去核卵母细胞中,组成重构体,通过激活使其发育成转基因重构胚胎，再把其移植到假孕母体,待其妊娠、分娩后便可得到转基因克隆动物。此法具有相对较大的优越性:转基因效率高,约是显微注射法的2倍；可对外源基因在供体细胞上是否整合、整合状况及整合位点预先进行准确鉴定和评估；也可以提前预测基因的表达情况；不存在位置效应且能大大节省供体和受体动物的数量及费用。

目的基因动物胎儿成纤维细胞卵母细胞受体导入注核

囊胚受体动物子宫

胚胎移植转基因动物妊娠成熟卵母细胞去核核移植获得的表达红色荧光蛋白的兔克隆胚

左图为光镜视野照片，右图为激发荧光的照片。核移植获得的表