2025版高考生物一轮总复习素养提升选择性必修3第10单元生物技术与工程第7讲基因工程的基本操作程序和应用及蛋白质工程

第10单元生物技术与工程第7讲基因工程的基本操作程序和应用及蛋白质工程构|建|网|络|情境试题规范作答|阅读下列材料，回答下列问题：基因的魔剪——CRISPR/Cas系统二倍体马铃薯存在自交不亲和的现象，导致无法运用种子种植马铃薯①。二倍体马铃薯的自交不亲和是由核糖核酸酶基因(S－RNase)限制的，科研人员通过基因编辑技术敲除了马铃薯的S－RNase基因，获得自交亲和的二倍体马铃薯②，为马铃薯杂交育种供应了新的技术。如图是科研人员用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除S－RNase基因的示意图。(1)用于编辑不同基因的CRISPR/Cas9复合物中向导RNA碱基序列不同，因此首先要确定S－RNase基因中的待编辑序列，可以通过PCR技术扩增S－RNase基因③，作为编码特定向导RNA的模板。扩增时须要依据S－RNase基因的脱氧核苷酸序列设计引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端起先连接脱氧核苷酸。(2)CRISPR/Cas9系统能精准识别相关基因，依据的原理是向导RNA与目标DNA发生碱基互补配对；Cas9蛋白可催化磷酸二酯键(填化学键名称)水解，剪切特定DNA片段。(3)欲检测经上述基因编辑技术得到的植株是否已具有自交亲和性状，最简便的方法是让该植株自交，视察能否产生种子。【解题策略】真|题|再|现1．(2024·浙江卷)紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复(NER)”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症(XP)患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后起先发展成皮肤癌。下列叙述错误的是(C)A．修复过程须要限制酶和DNA聚合酶B．填补缺口时，新链合成以5′到3′的方向进行C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的缘由，可用突变累积说明解析：由图可知，修复过程中须要将损伤部位的序列切断，因此须要限制酶的参与；同时修复过程中，单个的脱氧核苷酸须要依次连接，要借助DNA聚合酶，A正确；填补缺口时，新链即子链的延长方向为5′到3′的方向进行，B正确；DNA有害损伤发生后，在细胞增殖中进行修复，保证DNA复制的正确进行，对细胞最有利，C错误；癌症的发生是多个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的缘由，可用突变累积说明，D正确。故选C。2．(2024·浙江卷)某探讨小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。试验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是(B)A．Gata3基因的启动子无法限制GFP基因的表达B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子解析：分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合在Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能限制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3－GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。故选B。3．(2024·山东卷)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是_RNA聚合酶__。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_限制酶切割位点、标记基因、复制原点等__(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_F2与R1或F1与R2__。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_a链__(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_J－V5融合蛋白__，条带2所检出的蛋白_不是__(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。解析：(1)基因表达载体中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。作为运载体必需具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组DNA分子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是平安的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分别出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推想为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2与R1或F1与R2。b是模板链，而依据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应当是3′－5′，非模板链(也就是a链)是5′－3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′－3′，引物延长的方向确定是5′－3′，所以引物结合的单链其方向是3′－5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′－5′的b链，故其序列应当与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J－V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。4．(2024·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。探讨者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发觉野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推想突变体的表型与其有关，开展相关试验。回答下列问题：(1)拟接受农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和运载体进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)转化后，T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分别及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培育基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培育基，选择阳性率约75%的培育基中幼苗接着培育。③将②中选出的T2代阳性植株自交(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培育基，阳性率达到100%的培育基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续探讨中检测该突变，探讨者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再运用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。答案：(3)③解析：(1)依据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此接受农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DAI基因后，应当用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①依据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T－DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培育基(含有卡那霉素)上，若在选择培育基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应当出现3∶1的性状分别比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应当选择阳性率约75%的培育基中幼苗接着培育。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培育基上，若某培育基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为须要选择的植株，即阳性率达到100%的培育基中的幼苗即为目标转基因植株。依据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：5．(2024·辽宁卷)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的缘由，探讨者从基因数据库中获得了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9kb(1kb＝1000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：(1)为获得phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经逆转录过程得到cDNA，将其作为PCR的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入EcoRⅠ和PstⅡ两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用T4_DNA连接酶(填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。相关限制酶的识别序列及切割位点名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割位点HindⅢA↓AGCTTTTCGA↑AEcoRⅠG↓AATTCCTTAA↑GPstⅡCAG↓CTGGTC↑GACPstⅠCTGC↓AGGA↑CGTCKpnⅠG↓GTACCCCATG↑GBamHⅠG↓GATCCCCTAG↑G注：箭头表示切割位点(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培育基上进行培育，随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培育并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分别，结果如图2，3号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中解析：(1)利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。(2)依据启动子和终止子的作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间，从图中看出，两者之间存在三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应当选择EcoRⅠ和PstⅡ两种不同限制酶；依据PstⅡ的酶切序列可知，其酶切产物为平末端，所以构建基因表达载体时，应当用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。(3)转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。(4)由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培育基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，假如用EcoRⅠ和PstⅡ两种酶切割重组质粒，电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0.9kb，所以对应电泳图中的菌落3。6．(2024·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探究药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端(填“3′端”或“5′端”)。(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的缘由是在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最终两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框变更，翻译出的氨基酸序列变更。修改扩增P基因时运用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数。(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC依据图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分别出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推想，药物A的作用是促进UBC与FLAG－P的结合；由②④组或③⑤组的差异推想，P△中缺失的特定序列的作用是P△中缺失的特定序列是与U