基于mRNA-LNP技术的（细胞）免疫治疗产品开发指南

GB/TXXXXX—XXXX基于mRNA-LNP技术的（细胞）免疫治疗产品开发指南范围本文件适用于基于mRNA-LNP技术的（细胞）免疫治疗产品开发的全流程和相关质量管理，包括mRNA-LNP制备及质量控制、工程化免疫细胞制备及质量控制、功能验证，以及物料管理、生产环境、生产设备、人员管理等须遵循的基本要求和原则，旨在帮助研究机构更好地利用mRNA-LNP技术开发细胞免疫治疗产品。本文件适用于科研机构、生产企业基于mRNA-LNP技术开发CAR-T或CAR-NK细胞等免疫治疗产品的全过程。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成对本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T29022粒度分析动态光散射法GB/T42398细胞培养洁净室设计技术规范GB50457医药工业洁净厂房设计标准JGJ91科研建筑设计标准ISO17867粒度分析-小角度X射线散射[Particlesizeanalysis—SmallangleX-rayscattering（SAXS）]中华人民共和国药典（简称《中国药典》）国家药包材标准免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）细胞制品研究与评价技术指导原则体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）体细胞临床研究工作指引（试行）药物非临床研究质量管理规范脂质体药物非临床药代动力学研究指导原则新药用辅料非临床安全性评价指导原则药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则药品包装材料与药物相容性试验指导原则医疗卫生机构开展研究者发起的临床研究管理办法药物临床试验质量管理规范中华人民共和国人类遗传资源管理条例化学药品与弹性体密封件相容性研究技术指导原则（试行）化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则（试行）化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则（试行）化学药品注射剂生产所用的塑料组件系统相容性研究技术指南（试行）国际人用药品注册技术协调会（ICH）E6（GoodClinicalPractice）来源于人或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评价（ViralSafetyEvaluationofBiotechnologyProductsDerivedfromCellLinesofHumanorAnimalOrigin）美国药典（TheUnitedStatesPharmacopoeia）术语和定义信使核糖核酸（mRNA）MessengerRNAmRNA是由DNA的一条链作为模板转录而来的单链核糖核酸，携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。在细胞内，mRNA通过与核糖体结合，并在tRNA（转运RNA）的帮助下，翻译成多肽链，进而形成蛋白质。mRNA在基因表达过程中起着承上启下的作用，它从DNA传递遗传信息，指导蛋白质的合成，从而控制生物体的生长、发育和功能。自扩增核糖核酸（saRNA）Self-amplifyingRNA自扩增RNA是一种能够以自身序列为模板，进行自我扩增的线性mRNA。saRNA主要衍生于甲病毒基因组，通过替换病毒结构蛋白的编码基因序列编码来构建。因此，saRNA保持了源于RNA病毒载体的自复制活性，在进入细胞内后可以像病毒一样，能够利用宿主细胞进行自我复制，并指示细胞持续制造治疗性蛋白质来发挥作用。环状RNA（circRNA）circularRNA一类单链闭合的RNA分子，由mRNA前体通过可变剪接产生，与传统的线性RNA不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。体外转录Invitrotranscription主要是以质粒DNA为模板通过体外转录得到RNA，常用的是以线性化质粒DNA或PCR扩增产物为模板利用RNA聚合酶在体外转录合成。PIE（PermutedIntron-Exon）系统一种将mRNA合成环状RNA的系统。通过序列设计将天然的内含子、外显子反向剪切而形成新的内含子-外显子构建体，可以在构建体中间插入目的序列，这个构建体为PIE系统。超滤ultrafiltration一项膜分离技术，主要以压力为动力，将大分子与小分子进行分离，常用于溶液中溶剂的置换，样品的纯化等。RNAR酶RNaseR具有催化功能的小分子RNA，属于生物催化剂。RNaseR能消化线性RNA（LinearRNA），但不能消化环状RNA（CircularRNA，circRNA）、套索RNA（LariatRNA）、3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA以及具有复杂二级结构的tRNA、5SRNA等。脂质纳米颗粒（LNP）lipidnanoparticle是一种由多个脂质成分构建的纳米级载体。它通常由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG化脂质组成。聚合物分散性指数（PDI）polydispersityindex一种描述颗粒尺寸分布均匀程度的参数。PDI的值越小，颗粒尺寸分布越均匀；反之，PDI的值越大，颗粒尺寸分布越不均匀。佐剂adjuvant与抗原同时或预先注射，可非特异性地增强或改变机体对抗原免疫应答的物质，称为佐剂。微流控microfluidic使用微管道（尺寸为数十到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为纳升到阿升）。氮磷比（N/P）nitrogenphosphorusratio基于阳离子胺氮（在阳离子脂质中）和核酸中磷酸基团浓度计算正负电荷之比。跨膜压（TMP）transmembranepressure纯化系统中跨越透析膜两侧的压力差。免疫原性immunogenicity能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。转录Transcription是遗传信息从DNA流向RNA的过程。即以双链DNA中的确定的一条链（模板链用于转录，编码链不用于转录）为模板，以A、U、C、G四种核糖核苷酸为原料，在RNA聚合酶催化下合成RNA的过程。质粒plasmid一类存在于细菌和真菌细胞中独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，通常携带一定数量的基因，是基因工程最常见的载体。外周血单个核细胞（PBMC）peripheralbloodmononuclearcell血液中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞、单核细胞、巨细胞、树突状细胞和少量其他细胞类型。核糖核酸酶（RNase）ribonuclease水解核糖核酸（RNA）中磷酸二酯键，生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶。脱氧核糖核酸酶（DNase）deoxyribonuclease水解脱氧核糖核酸（DNA）中磷酸二酯键，生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶。STR分析shorttandemrepeatSTR分型检测是一种用于检测人类及哺乳动物的基因组。T细胞T-lymphocyteT淋巴细胞来源于骨髓的多功能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。感受态细胞competentcell理化方法诱导细胞，吸收周围环境中的DNA分子，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。核苷酸nucleotide核苷酸是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物，又称核甙酸。自然杀伤细胞（NK）naturalkillercell自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。原液Bulk指用于制造最终配制物（Fillalformulation）或半成品（FinalBulk）的均一物质。缩略语3’UTR：3′非翻译区（3’Un-translatedregion）5’UTR：5′非翻译区（5’Un-translatedregion）ATP：腺嘌呤核苷三磷酸（adenosinetriphosphate）CAR：嵌合抗原受体（ChimericAntigenReceptor）CAR-T：嵌合抗原受体T细胞（chimericantigenreceptorTcell）CAR-NK：嵌合抗原受体NK细胞（chimericantigenreceptorNKcell）CAR-qPCR：测定CAR部分的qPCR方法（CARQuantitativePCR）CD3+：分化抗原簇3（ClusterofDifferentiation3）CD4+：分化抗原簇4（ClusterofDifferentiation4）CD8+：分化抗原簇8（ClusterofDifferentiation8）CRS：细胞因子释放综合征（cytokinereleasesyndrome）DLT：剂量限制性毒性（Doselimitingtoxicity）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）ddPCR：微滴式数字PCR（DropletDigitalPCR）dsRNA：双链核糖核酸（double-strandedRNA）ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay）FACS：流式细胞术（FlowCytometry）FOB：功能观察试验组合（FunctionalObservationBattery）GTP：鸟苷三磷酸（Guanosinetriphosphate）HHV：人类疱疹病毒（Humanherpesvirus）HPLC：高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography）HPLC-CAD：高效的高效液相色谱-电雾式检测器（high-performanceliquidchromatography-diodearraydetection）HLA：人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen）IIT：研究者发起的临床试验（Investigator-InitiatedClinicalTrial）IL-2：白细胞介素-2（interleukin2）IL-4：白细胞介素-4（interleukin4）IL-6：白细胞介素-6（interleukin6）IL-10：白细胞介素-10（interleukin10）INF-γ：干扰素γ（Interferongamma）IVT：体外转录（Invitrotranscription）IST：药企发起的临床试验（Industry-SponsoredClinicalTrial）mRNA：信使RNA（MessagerRNA）mRNAseq：转录组测序技术（mRNAsequencing）nickedRNA：circRNA的开环异构体NAT：核酸扩增检测法（nucleicacidamplificationtest）NTP：核苷三磷酸（Nucleosidetriphosphate）PBMC：外周血单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）Poly（A）：聚腺嘌呤（Polyadenine）RT-PCR：逆转录PCR（ReverseTranscriptionPCR）preRNA：前体RNA（precursorRNA）qPCR：定量PCR（QuantitativePCR）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）SAXS：X射线小角散射（small-anglex-rayscattering）TNF-α：肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactor）mRNA-LNP制备及质量控制模板质粒序列设计与合成mRNA模板质粒序列设计与合成线性mRNA模板质粒序列设计与合成DNA转录模板设计宜包括：目的基因。宜分别阐述其序列来源、基因和氨基酸序列、共翻译机制，以及在疾病预防或治疗中的作用；功能性元件的设计及确认研究结果。功能性元件的设计宜包括转录启动子的选择，帽子结构设计，5’UTR和3’UTR的设计，信号肽和蛋白标签的设计（如有），Poly（A）加尾结构及长度设计，线性化位点选择，所用核苷三磷酸（NTP）类型及其修饰信息等。若对编码目的蛋白的mRNA序列进行了任何修饰、序列优化（如密码子优化等），宜保留修饰或序列优化的依据与目的（如提高mRNA翻译效率、降低模板合成难度、降低先天免疫原性、增加稳定性等）。宜保留修饰或优化后的序列示意图等，并对序列修饰或优化的利弊进行权衡分析，保留确认的支持性研究结果。自复制mRNA模板质粒序列设计与合成使用自复制mRNA载体来表达目的蛋白，除了阐述目的基因外，需保留以下信息：编码病毒RNA依赖性RNA聚合酶复合物（复制子）的序列来源，并阐述其功能；若复制子序列含有氨基酸突变，阐述突变的依据和功能变化；若自复制mRNA的加帽序列与病毒天然起始序列不一致，阐述选择依据和效果对比情况；若病毒复制子与目的蛋白分别位于不同的mRNA分子上，需额外的控制措施（比如二者长度、纯度、加帽类型和摩尔比例）以确保它们的协同作用，并予以说明。若对自复制mRNA序列进行了任何修饰、序列优化，宜保留修饰或序列优化的依据与目的。宜保留修饰或优化后的序列示意图等，并对序列修饰或优化的利弊进行权衡分析，保留确认的支持性研究结果。circRNA模板质粒序列设计与合成序列设计策略circRNA成环策略包括化学合成法、酶促连接法、Ⅰ型内含子自剪接系统、Ⅱ型内含子自剪接系统等，宜阐述模板设计的环化方式及成环原理。目的基因宜阐述目的基因来源、基因和氨基酸序列及蛋白结构，及其表达蛋白在疾病预防或治疗中的作用或作用机理。关注序列筛选及优化过程，若对编码目的基因序列进行了任何修饰、序列优化或序列改构，宜保留修饰或序列优化的依据与目的。宜保留结构示意图等，宜与数据库收录的相关序列进行序列比对，并对基因修饰或序列改构的利弊进行权衡分析，保留确认的支持性研究结果。功能性元件宜提供功能性元件的设计及确认研究结果。功能性元件的设计宜包括转录启动子、自剪切内含子的选择，IRES结构设计，5’UTR和3’UTR的设计，外显子残留，Poly（A）加尾结构及长度设计，增强转录及翻译效率相关元件、选择性标记、复制起始位点、额外引入的基因序列等的来源及选择依据，明确完整的带注释的序列信息。宜设计合理线性化酶切位点，避免多余序列残留。质粒构建时宜避免使用β-内酰胺类抗生素抗性基因。质粒载体骨架部分序列设计与合成对质粒模板骨架中包含的控制元件和选择标记的序列与来源进行阐述，如：转录启动子、转录终止子、抗生素抗性标记、质粒复制子、多克隆位点、线性化位点等。宜选择高拷贝的质粒复制子（如pUC/pBR322），以提升质粒产量。抗生素使用应符合《中国药典》的相关要求，避免使用β-内酰胺类抗生素抗性基因。多克隆位点宜包含常见且唯一的限制性内切酶位点如HindIII、BamHI、NotI等。明确转录启动子（如T7启动子）及其下游的加帽起始序列。明确终止子的序列及其功能。宜设计合理线性化酶切位点，避免多余序列残留。模板质粒序列设计与合成质量控制对转录模板的控制元件和选择标记的序列与来源进行阐述，如：转录启动子、转录终止序列、抗生素抗性标记等进行分析。抗生素使用应符合《中国药典》的相关要求。提供构建和制备转录模板质粒的详细信息和步骤、鉴定及确证方法。宜结合工程菌种子库的检定对转录模板质粒进行全基因序列分析及确认，提供用于生产mRNA或circRNA的转录模板的全长核苷酸序列，宜分析转录模板的控制元件、插入的目的基因序列、选择标记基因有无变异等。质粒模板中包含Poly（A）序列，宜通过测序等方法确保质粒模板中Poly（A）序列的完整性可以满足下游应用。建立种子批系统建立种子批的关键起始原材料包括质粒DNA和感受态细胞，宜有清晰的来源和完整的溯源信息，对转录模板质粒宜明确其控制元件和选择标记的序列与来源，如转录启动子、抗生素抗性标记等。将合格的目的质粒转化至适宜的宿主菌，经克隆筛选后建立至少两级种子批系统，宜避免存在其他细菌、真菌和噬菌体的污染，以及确保在限定代次内具有遗传稳定性。原始种子库的建立过程包括模板质粒转化宿主菌、单克隆筛选和传代培养。其中单克隆筛选宜重点关注模板质粒的产量、超螺旋纯度、Poly（A）完整性等。主种子库和工作种子库的建立过程包括种子复苏、传代培养和分装冻存。建库过程宜遵循《药品生产质量管理规范》要求，确保无外源因子污染和交叉污染。建立种子库使用的物优先采用风险级别较低的物料，如国家已批准上市的药品，药用级原辅料，GMP级物料，宜避免使用人源或动物源性物料。对各级种子库，宜明确制备规模、扩增条件、贮存条件等信息。种子库标签标明菌种编号、模板质粒名称、代次、批号、规格和制备日期等内容。种子库的管理宜遵循《中国药典》通则“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”的要求。种子库检定和稳定性研究种子批检定宜遵循《中国药典》通则“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”和“人用基因治疗制品总论”的要求。种子批的检定项目一般包括菌落形态、鉴别、染色镜检、生化特性、活率、抗生素抗性、电镜检查、目的基因和其他元件测序、限制性酶切图谱等，种子批宜无其他细菌、真菌、噬菌体等污染。对主种子库和工作种子库进行传代稳定性研究，使用模拟或代表实际生产工艺的条件开展传代稳定性研究，种子批的遗传和表型特征宜能满足生产需求。传代稳定性考察的指标一般包括质粒序列、质粒限制酶切图谱、质粒保有率、质粒拷贝数、超螺旋纯度、Poly（A）完整性等。根据研究结果明确种子批的限定传代代次。限定传代代次需要覆盖生产规模的最大代次。宜对主种子库和工作种子库开展贮存稳定性研究，关注在贮存条件下和时长内种子库的活菌数和活率等，种子批的贮存稳定性宜能满足生产需求。模板质粒制备模板质粒的制备应基于种子库系统，一般包括种子库复苏和扩增、发酵、纯化和分装保存，宜遵循《药品生产质量管理规范》要求，确保无外源因子污染和交叉污染。宜采取适当的措施防止DNase等污染，包括环境、耗材及原料中的DNase消除和残留检测。模板质粒的制备过程中不宜使用人源和动物源性材料。在发酵过程中不宜使用β-内酰胺类抗生素。如需使用其他种类的抗生素，如卡那霉素，宜说明使用的必要性，并对模板质粒的纯化中间体及成品的抗生素残留量进行控制和安全性评估。模板质粒的纯化工艺单元的设定宜考虑后续生产规模放大的可行性，宜采用可放大的超滤和层析操作单元。模板质粒的成品分装规格宜与后续的质粒DNA线性化规模相适应，宜开展储存稳定性研究。模板质粒的成品标签标明质粒名称、贮存条件、批号、规格、生产日期等信息。模板质粒质量控制宜建立模板质粒质量控制要求，根据不同的mRNA-LNP制备工艺及研发侧重点选取相应的质量控制指标。特别注意外源因子污染和交叉污染，宜采取适当的措施防止DNase等污染，包括环境、耗材及原料中的DNase消除和残留检测。无菌可参照《中国药典》通则“1101无菌检查法”，或选用快速无菌检查法如ATP生物发光法、固相细胞计数、呼吸作用进行检测。细菌内毒素按照《中国药典》通则“1143细菌内毒素检查法：凝胶法、光度测定法”检测。外观可参照《中国药典》通则“0901溶液颜色检查法”、“0902澄清度检查法”、“0904可见异物检查法”进行检测。pH按照《中国药典》通则“0631pH值测定法”检测。质粒纯度（A260/280）按照《中国药典》通则“0401紫外-可见分光光度法”检测。宿主细胞蛋白质残留按照《中国药典》通则“3412菌体蛋白质残留量测定法”检测。宿主细胞DNA残留量按照《中国药典》通则“3407外源性DNA残留量测定法”检测。宿主细胞RNA残留量可参照《中国药典》通则“0541电泳法”、“0542毛细管电泳”，或选用PCR法、荧光毛细管电泳CE法进行检测。全序列测定可参照《中国药典》指导原则“9108DNA测序技术指导原则”，或选用sanger法进行检测。质粒浓度（A260）按照《中国药典》通则“0401紫外-可见分光光度法”检测。RNase残留可参照荧光探针法（详见附录A），或选用ELISA法进行检测。限制性内切酶鉴别可参照《中国药典》通则“0541电泳法”、“0542毛细管电泳”进行检测。Poly（A）完整性可参照《中国药典》指导原则“9108DNA测序技术指导原则”、“0542毛细管电泳法”，或选用sanger法进行检测。超螺旋比例可参照《中国药典》通则“0512高效液相色谱法”、“0513离子色谱法”、“0542毛细管电泳法”、“3431质粒DNA构象测定法”进行检测。质量控制指标汇总见表1。表1模板质粒质量控制指标汇总表质量属性质量控制指标推荐检测方法参考限值鉴别限制性内切酶鉴别《中国药典》三部电泳法（通则0541）毛细管电泳法（通则0542）实测条带应与理论条带一致全序列测定《中国药典》四部DNA测序技术指导原则（9108）；Sanger法非PloyA区的实测序列应与理论序列一致Poly（A）完整性《中国药典》四部DNA测序技术指导原则（通则9108）；Sanger法理论长度±论长度《中国药典》三部毛细管电泳法（通则0542）-含量质粒浓度（A260）《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）1.0±0.1mg/ml纯度质粒纯度（A260/280）《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（0401）1.8-2.0超螺旋比例《中国药典》三部通则高效液相色谱法（0512）、离子色谱法（0513）、毛细管电泳法（0542）、质粒DNA构象测定法（3431）≥90%产品及工艺相关杂质宿主细胞残留蛋白《中国药典》三部菌体蛋白质残留量测定法（通则3412）<0.10%宿主DNA残留量《中国药典》三部外源性DNA残留量测定法（通则3407）<1.0%宿主RNA残留量《中国药典》三部电泳法（通则0541）-《中国药典》三部毛细管电泳（通则0542）-PCR法-荧光毛细管电泳CE法-RNase残留荧光探针法≤3.125×10-10mg/mlELISA法-安全性细菌内毒素《中国药典》三部细菌内毒素检查法：凝胶法（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定《中国药典》三部细菌内毒素检查法：光度测定法（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定无菌《中国药典》三部无菌检测法（通则1101）；ATP生物发光法、固相细胞计数、呼吸作用阴性其它pH《中国药典》三部pH值测定法（通则0631）依据方案而定外观《中国药典》三部溶液颜色检查法（通则0901）、澄清度检查法（通则0902）、可见异物检查法（通则0904）无色澄明/澄清液体质粒DNA线性化制备流程制备流程：酶切→阴离子交换层析→超滤浓缩→除菌过滤→分装。模板质粒的线性化模板质粒的线性化宜遵循《药品生产质量管理规范》要求，宜使用一次性设备和耗材，避免外源因子污染和交叉污染。宜采取适当的措施防止DNase等污染，包括环境、耗材及原料中的DNase消除和残留检测。模板质粒的线性化过程宜通过被确认过的工艺参数，获得线性化比例符合质量控制要求的线性化DNA。线性化质粒的纯化线性化质粒的纯化宜遵循《药品生产质量管理规范》的要求，明确制造工艺各单元操作，同时按照经过验证和批准后的操作规程的要求进行。纯化过程宜建立合理的中间体质量控制程序，监测和控制工艺相关杂质，如宿主DNA残留，宿主蛋白残留，和宿主RNA残留。线性化质粒的分装在无菌条件下，使用符合要求的包装材料对除菌过滤后的样品进行分装，分装精度、规格、包材宜经过确认和验证。样品宜储存在经确认和验证过的合适的储存条件及环境下。线性化质粒DNA原液质量控制宜建立线性化质粒DNA原液质量控制要求，根据不同的mRNA-LNP制备工艺及研发侧重点选取相应的质量控制指标。细菌内毒素、外观、pH、A260/A280纯度、宿主细胞蛋白质残留、宿主细胞DNA残留量、宿主细胞RNA残留、序列测定、浓度、RNase残留按照—1检测。质粒检查按照《中国药典》通则“0541电泳法”检测。线性比例可参照《中国药典》通则“0512高效液相色谱法”、“0513离子色谱法”、“0542毛细管电泳法”、“3431质粒DNA构象测定法”进行检测。总蛋白残留可参照《中国药典》通则“0731蛋白质含量测定法”，或选用荧光法（详见附录D）进行检测。微生物限度按照《中国药典》通则“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”检测。质量控制指标汇总见表2。表2线性化质粒原液质量控制指标汇总表质量属性质量控制指标推荐检测方法参考限值理化性质外观《中国药典》三部溶液颜色检查法（通则0901）、澄清度检查法（通则0902）、可见异物检查法（通则0904）无色澄明/澄清液体浓度《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）1.0±0.1mg/mlpH《中国药典》三部pH值测定法（通则0631）依据方案而定鉴别序列准确性《中国药典》四部DNA测序技术指导原则（9108）；Sanger法与理论序列相符质粒检查《中国药典》三部电泳法（通则0541）酶切后无杂带且条带符合理论大小纯度A260/A280纯度《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）1.8-2.0线性比例《中国药典》三部通则高效液相色谱法（通则0512）、离子色谱法（通则0513）、毛细管电泳法（通则0542）、质粒DNA构象测定法（通则3431）≥90.0%工艺相关杂质总蛋白残留《中国药典》三部蛋白质含量测定法（通则0731）≤1.0%荧光法-宿主细胞DNA残留量《中国药典》三部外源性DNA残留量测定法（通则3407）<1.0%宿主细胞蛋白质残留《中国药典》三部菌体蛋白质残留量测定法（通则3412）<0.10%宿主细胞RNA残留量《中国药典》三部电泳法（通则0541）-《中国药典》三部毛细管电泳（通则0542）-PCR法-荧光毛细管电泳CE法-RNase残留荧光探针法检测≤3.125×10-10mg/ml安全性细菌内毒素《中国药典》三部细菌内毒素检查凝胶法：凝胶限度试验（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定《中国药典》三部细菌内毒素检查法：光度测定法（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定微生物限度《中国药典》三部非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）<1cfu/mlmRNA合成线性mRNA合成mRNA的合成所用原材料遵循《药品生产质量管理规范》的要求，根据物料风险等级建立相适应的控制措施。mRNA生产过程需要进行原料药制备，再进行制剂的制备，原料药制备过程中常使用PCR产物或者质粒作为模板，宜制定模板的质量标准。mRNA原料药和制剂生产过程遵循《药品生产质量管理规范》要求，宜保证纯度以及无外源因子污染和交叉污染。宜采取适当的措施防止RNase等污染，包括环境、耗材及原料中的RNase消除和残留检测。研究与优化mRNA的关键工艺参数，根据不同的mRNA-LNP制备工艺选取相应的关键工艺参数，关键工艺参数如下：体外转录工艺中的反应体系、RNA聚合酶浓度以及活性标准、帽子类似物（共转录体系）、NTP浓度、转录时间、温度、Mg2+、补料方式、终止反应条件等；DNA酶处理工艺（如有）中的DNA酶浓度、纯度酶活性标准、处理时间、温度、补料方式、终止反应条件等；酶法加帽工艺（如有）宜研究RNA反应浓度、加帽反应缓冲体系、加帽酶浓度纯度活性标准、物料投料比（如mRNA、鸟苷三磷酸（GTP）、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、RNA酶抑制剂、加帽酶等）、补料方式、反应温度、反应时间等；对加帽类型（如有）及不同加帽类型的比例进行研究，有利于mRNA转录的5’UTR和3’UTR的选择和优化；加Poly（A）尾工艺（如有）宜研究加尾反应体系、ATP浓度、加尾酶浓度纯度活性标准、反应温度、时间、补料方式等；去磷酸化工艺中（如有）的磷酸酶浓度、反应时间、补料方式等；如涉及修饰核苷酸，宜明确被修饰的核苷酸、修饰类型、修饰后的纯化方法和纯度、投料比例等。且在保证不影响mRNA转染的情况下，对修饰进行优化，促进mRNA的稳定性；mRNA纯化（如有）宜研究纯化方式、纯化条件、纯化后mRNA浓度、纯度、完整性、杂质残留等；过滤除菌工艺（如有）宜研究过滤后mRNA的生物活性；mRNA冻干（如有）宜研究冻干方式、冻干条件、分装方式、冻干复溶后mRNA浓度质量，如浓度、纯度、完整性、溶解性、表达蛋白效力等；circRNA合成circRNA合成所用原材料宜遵循《药品生产质量管理规范》的要求，根据物料风险等级建立相适应的控制措施。DNA模板的质量控制应当符合《中国药典》要求，保证无外源因子污染和交叉污染。宜采取适当的措施防止RNase污染。circRNA制备宜明确circRNA环化方法，包括以下几种：化学连接法：可通过溴化氰（BrCN）或1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）将线性RNA的首尾连接成环。酶法连接：常用于RNA环化的酶有3种，T4DNA连接酶1（T4Dnl1）、T4RNA连接酶1（T4Rnl1）和T4RNA连接酶2（T4Rnl2）。PIE系统：常用于RNA环化PIE系统-Ⅰ型内含子自剪接、PIE系统-Ⅱ型内含子自剪接。宜对circRNA合成的体外转录、DNA酶处理、RNA环化等工艺步骤的关键工艺参数进行研究与优化，以提高产率和效率，对关键工艺参数及其控制范围进行确认。宜研究与优化circRNA合成关键工艺参数，根据不同的mRNA-LNP制备工艺选取相应的关键工艺参数，关键工艺参数如下：体外转录工艺参数：RNA聚合酶浓度、NTP浓度、模板浓度、转录时间、温度、Mg2+、终止反应条件等；DNA酶处理工艺参数（如有）：DNA酶浓度、处理时间、温度、终止反应条件等；RNA环化工艺参数（如有）：IVT产物浓度、温度、反应时间、GTP浓度、Mg2+浓度、连接酶浓度等；如涉及修饰核苷酸，宜明确被修饰的核苷酸、修饰类型、修饰后的纯化方法和纯度、投料比例等。mRNA合成质量控制线性mRNA合成质量控制宜建立mRNA合成质量控制要求，根据不同的mRNA-LNP制备工艺及研发侧重点选取相应的质量控制指标。外观、pH、细菌内毒素、无菌按照—检测。总蛋白残留可参照《中国药典》通则“0731蛋白质含量测定法”，或选用荧光法（详见附录D）进行检测。mRNA序列长度可参照《中国药典》通则“0541电泳法”、“0542毛细管电泳法”进行检测。mRNA纯度可参照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”、“0401紫外-可见分光光度法”进行检测。DNA模板残留量按照《中国药典》通则“3407外源性DNA残留量测定法”检测。mRNA含量可参照《中国药典》通则“0401紫外-可见分光光度法”，或选用《美国药典》“mRNA疫苗质量分析方法-指南草案”RiboGreen荧光检测法（详见附录E），或选用“荧光PCR法”、“ddPCR法”进行检测。dsRNA残留量可参照《中国药典》通则“3429免疫化学法”，或选用《美国药典》“mRNA疫苗质量分析方法-指南草案”ELISA法（详见附录B）进行检测。金属元素残留量按照《中国药典》通则“0412电感耦合等离子体质谱法”检测。DNase残留荧光探针法，详见附录C。游离单核苷酸（NTPs）残留量可参照《中国药典》通则“0512高效液相色谱法”、“0431质谱法”进行检测。酶残留量按照《中国药典》通则“3429免疫化学法”检测。序列完整性及准确性（特别是关键元件）可参照《中国药典》指导原则“9109标准核酸序列建立指导原则”，或选用mRNAseq法进行检测。有机溶剂残留量按照《中国药典》通则“3200化学残留物测定法”检测。帽子类似物残留量按照《中国药典》通则“0512高效液相色谱法”检测。加帽率可参照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”、“0431质谱法”、“0512高效液相色谱法”进行检测。ploy（A）尾长度可参照《中国药典》通则“0431质谱法”、“0512高效液相色谱法”、“0542毛细管电泳法”进行检测。表达成蛋白的能力使用基于细胞的转染实验检测。不完整mRNA按照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”检测。mRNA聚集体按照《中国药典》通则“0541电泳法”初步判断，“0512高效液相色谱法”、“0514分子排阻色谱法”进行检测。生物负载量按照《中国药典》通则“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”检测。质量控制指标汇总见表3。表3mRNA合成质量控制指标汇总表质量属性质量控制指标推荐检测方法参考限值理化性质pH《中国药典》三部pH值测定法（通则0631）依据方案而定外观《中国药典》三部溶液颜色检查法（通则0901）、澄清度检查法（通则0902）、可见异物检查法（通则0904）无色澄明/澄清液体鉴别mRNA序列长度《中国药典》三部电泳法（通则0541）依据方案而定序列完整性及准确性（特别是关键元件）《中国药典》四部DNA测序技术指导原则（9108）；mRNAseq法与理论序列相符ploy（A）尾长度和均一性《中国药典》三部质谱法（通则0431）、高效液相色谱法（通则0512）依据方案而定《中国药典》三部高效液相色谱法（通则0512）依据方案而定《中国药典》三部毛细管电泳法（通则0542）依据方案而定含量mRNA含量《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）；RiboGreen荧光检测法、荧光PCR法、ddPCR法依据方案而定纯度mRNA纯度《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）1.8-2.0《中国药典》三部毛细管电泳法（通则0542）＞30%加帽率《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）依据方案而定《中国药典》四部质谱法（通则0431）≥90.0%《中国药典》四部高效液相色谱法（通则0512）依据方案而定效力表达成蛋白的能力基于细胞的转染实验依据方案而定产品相关杂质不完整mRNA《中国药典》三部毛细管电泳法（通则0542）≤10%mRNA聚集体《中国药典》三部电泳法（通则0541）≤10%《中国药典》三部高效液相色谱法（通则0512）、分子排阻色谱法（通则0514）依据方案而定dsRNA残留《中国药典》三部免疫化学法（通则3429）；ELISA法＜0.1/％工艺相关杂质DNA模板残留量《中国药典》三部外源性DNA残留量测定法（通则3407）<1.0%总蛋白残留《中国药典》三部蛋白质含量测定法（通则0731）≤1.0%荧光法-酶残留量《中国药典》三部免疫化学法（通则3429）≤5%游离单核苷酸（NTPs）残留量《中国药典》三部高效液相色谱法（通则0512）、质谱法（通则0431）≤5%帽子类似物残留量《中国药典》三部高效液相色谱法（通则0512）≤5%有机溶剂残留量《中国药典》三部化学残留物测定法（通则3200）-金属元素残留量《中国药典》四部电感耦合等离子体质谱法（通则0412）-DNase残留荧光探针法≤1.25×10-6U/μl安全性无菌《中国药典》三部无菌检查法（通则1101）；ATP生物发光法、固相细胞计数、呼吸作用阴性细菌内毒素《中国药典》三部凝胶限度试验法（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定《中国药典》三部细菌内毒素检查法：光度测定法（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定生物负载量微生物计数《中国药典》四部非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）＜1cfu/10mlcircRNA合成质量控制宜建立circRNA合成产物质量控制要求，根据不同的mRNA-LNP制备工艺及研发侧重点根据不同的mRNA-LNP制备工艺选取相应的质量控制指标。外观、pH、细菌内毒素、无菌按照—检测。circRNA序列长度、circRNA纯度、总蛋白残留、DNA模板残留量、circRNA含量、dsRNA残留量、金属元素残留量、DNase残留、游离单核苷酸（NTPs）残留量、酶残留、序列完整性及准确性、有机溶剂残留量按照.2—.13检测。preRNA可参照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”检测，或使用RT-PCR和特异性引物检测preRNA的存在，以评估转录过程中的效率和精确性。内含子片段可参照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”检测，或采用特异性PCR和电泳技术检测是否有未正确剪接的内含子片段，以确保RNA的成熟和功能性。nickedRNA可参照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”检测，或采用灵敏的电泳分析，识别和定量可能存在的nickedRNA，以评估RNA合成过程中的完整性。RNaseR耐受性可参照《中国药典》通则“0541电泳法”检测，或处理样品后用RNaseR酶处理，通过RT-PCR和电泳确认circRNA的耐酶性，以验证其环状结构的完整性和稳定性。环化比例可参照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”，或选用qPCR法进行检测，或通过RT-PCR结合特异性引物，定量环化和非环化RNA的比例，确保产品的一致性。环化位点可参照《中国药典》指导原则“9109标准核酸序列建立指导原则”检测。或逆转录反应后，按照Sanger法检测。或采用RT-PCR结合测序技术定位circRNA的环化位点，确保环化的特异性和准确性。质量控制指标汇总见表4。表4circRNA体外合成质量控制指标汇总表质量属性质量控制指标推荐检测方法参考限值理化性质pH《中国药典》三部pH值测定法（通则0631）依据方案而定外观《中国药典》三部溶液颜色检查法（通则0901）、澄清度检查法（通则0902）、可见异物检查法（通则0904）无色澄明/澄清液体鉴别circRNA序列长度《中国药典》三部电泳法（通则0541）符合预定设计序列完整性及准确性《中国药典》四部DNA测序技术指导原则（9108）；mRNAseq法与理论序列相符环化位点《中国药典》四部标准核酸序列建立指导原则（9109）；Sanger法、RT-PCR结合测序技术环化位点需准确无误，匹配设计序列RNaseR耐受性《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）；RT-PCR经RNaseR处理后，circRNA不应有明显降解含量circRNA含量《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）；荧光PCR法、ddPCR法根据产品规格确定纯度circRNA纯度《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）、毛细管电泳法（通则0542）电泳图谱应显示单一清晰条带，无杂质峰环化比例《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）；qPCR法、RT-PCR结合特异性引物依据方案而定产品相关杂质preRNA《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）；RT-PCR和特异性引物依据方案而定内含子片段《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）；特异性PCR不可检出nickedRNA《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）；灵敏的电泳不可检出dsRNA残留量《中国药典》三部免疫化学法（通则3429）；ELISA法依据方案而定工艺相关杂质DNA模板残留量《中国药典》三部外源性DNA残留量测定法（通则3407）<1.0%总蛋白残留《中国药典》三部蛋白质含量测定法（通则0731）≤1.0%荧光法-酶残留量《中国药典》三部免疫化学法（通则3429）-游离单核苷酸（NTPs）残留量《中国药典》三部高效液相色谱法（通则0512）、质谱法（通则0431）-金属元素残留量《中国药典》四部电感耦合等离子体质谱法（通则0412）金属元素残留量应符合国家药典或相关行业标准，具体值根据使用的化学试剂和工艺不同而定有机溶剂残留量《中国药典》三部化学残留物测定法（通则3200）-DNase残留荧光探针法≤1.25×10-6U/μl安全性无菌《中国药典》三部无菌检查法（通则1101）；ATP生物发光法、固相细胞计数、呼吸作用阴性细菌内毒素《中国药典》三部细菌内毒素检查凝胶法：凝胶限度试验（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定《中国药典》三部细菌内毒素检查法：光度测定法（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定mRNA纯化线性mRNA纯化mRNA纯化所用物料宜优先采用风险级别较低的物料，根据物料风险等级建立相适应的控制措施。mRNA纯化生产过程宜遵循《药品生产质量管理规范》要求，保证无外源因子污染和交叉污染。宜采取适当的措施防止RNase污染，包括环境、耗材及原料中的RNase消除和残留检测。mRNA的纯化工艺单元的设定需要考虑后续生产规模放大的可行性，宜采用可放大的超滤和层析操作单元。宜对mRNA纯化工艺参数（如层析介质的选择、载量、上样和洗脱溶液条件、超滤膜截留分子量、流速和跨膜压等）进行研究和优化，开发稳定的纯化工艺。宜对mRNA纯化工艺建立相应的过程控制程序，包括纯化产物检测，如mRNA浓度、mRNA完整性、Poly（A）完整性、产品及工艺相关杂质去除率等，确保mRNA的纯度和结构完整性。宜明确mRNA纯化工艺中各单元操作的目的，进行工艺相关杂质清除研究。纯化后mRNA原液的保存溶液和分装规格应与后续的LNP制备过程相适应。并开展储存稳定性研究，制定合理的储存时长和储存条件。mRNA原液的标签需标明mRNA名称、贮存条件、批号、规格、生产日期等信息。circRNA纯化circRNA纯化所用原材料宜遵循《中国药典》“生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程”要求，并根据物料风险等级建立相适应的控制措施。circRNA纯化生产过程宜遵循标准的实验操作规程和安全规范，确保可重复性和安全性，保证无外源因子污染和交叉污染。宜采取适当的措施防止RNase污染，包括环境、耗材及原料中的RNase消除和残留检测。circRNA纯化工艺单元的设定需考虑后续生产规模放大的可行性，宜采用可放大的超滤和层析操作单元。宜明确circRNA纯化工艺中各纯化步骤的目的，并研究各纯化步骤的杂质去除率。如采用T4连接酶法制备circRNA，所制的circRNA与前体片段大小相同，宜详细说明其纯度的评估方式。若采用RNaseR消除前体，宜评估RNaseR对环的结构或完整性的影响。宜对circRNA纯化工艺参数（如层析介质的选择依据、载量、杂质去除率、上样和洗脱溶液条件、超滤膜截留分子量、流速和跨膜压、R酶消化等）进行研究和优化，开发稳定的纯化工艺。宜对circRNA纯化工艺建立相应的过程控制程序，包括纯化产物检测，如RNA浓度、RNA完整性、环化接口验证、circRNA纯度、R酶消化、产品及工艺相关杂质去除率等，确保circRNA的纯度和结构完整性。circRNA原液成品的溶剂宜与LNP包封过程中的溶剂相同。宜对circRNA原液开展稳定性研究，以确定合理的储存条件和时长。circRNA原液的标签需标明circRNA名称、贮存条件、批号、规格、生产日期等信息。mRNA原液质量控制线性mRNA原液质量控制宜建立mRNA原液质量控制要求，根据不同的mRNA-LNP制备工艺及研发侧重点选取相应的质量控制指标。外观、pH、细菌内毒素、无菌按照—检测。mRNA纯度、DNA模板残留量、mRNA含量、dsRNA残留量按照.4—.7检测。帽子类似物残留量、加帽率、poly（A）尾长度、目的蛋白表达按照.13—.16检测。mRNA测序可参照《中国药典》指导原则“9109标准核酸序列建立指导原则”，或选用sanger法、高通量测序技术进行检测。mRNA鉴别按照《中国药典》通则“0541电泳法”检测。A260/A230纯度按照《中国药典》通则“0401紫外-可见分光光度法”检测。NTP残留（A、G、C、U）按照《中国药典》通则“0512高效液相色谱法”检测。总蛋白残留可参照《中国药典》通则“0731蛋白质含量测定法”，或选用荧光法（详见附录D）进行检测。mRNA完整性可参照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”，或选用琼脂糖凝胶电泳进行检测。工具酶残留如T7RNA聚合酶按照《中国药典》通则“3429免疫化学法”检测。质量控制指标汇总见表5。表5mRNA原液质量控制指标汇总表质量属性质量控制指标推荐检测方法参考限值鉴别mRNA测序《中国药典》四部DNA测序技术指导原则（9108）；Sanger法；高通量测序技术应与理论序列一致mRNA鉴别《中国药典》三部电泳法（通则0541）应与对照品条带一致含量mRNA含量《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）；RiboGreen荧光检测法、荧光PCR法、ddPCR法依据方案而定完整性mRNA完整性《中国药典》三部毛细管电泳法（通则0542）；琼脂糖凝胶电泳≥85%纯度mRNA纯度《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）-《中国药典》第三毛细管电泳法（通则0542）≥85%加帽率《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）≥90.0%《中国药典》四部质谱法（通则0431）-《中国药典》四部高效液相色谱法（通则0512）-Poly（A）尾长度《中国药典》三部质谱法（通则0431）、高效液相色谱法（通则0512）分布范围：理论长度±20%《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）-dsRNA残留量《中国药典》三部免疫化学法（通则3429）；ELISA法≤0.50%总蛋白残留《中国药典》三部蛋白质含量测定法（通则0731）≤1.0%荧光法-NTP残留（A、G、C、U）T7RNA聚合酶残留量《中国药典》三部免疫化学法（通则3429）≤0.5μg/mgRNA《中国药典》三部高效液相色谱法（通则0512）A、G、C、U均≤0.1%（w/wmRNA）帽子类似物残留量《中国药典》三部高效液相色谱法（通则0512）≤0.1%（w/wmRNA）DNA模板残留量《中国药典》三部外源性DNA残留量测定法（通则3407）≤0.1%（w/wmRNA）无菌《中国药典》三部无菌检查法（通则1101）；ATP生物发光法、固相细胞计数、呼吸作用阴性细菌内毒素《中国药典》三部细菌内毒素检查凝胶法：凝胶限度试验（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定《中国药典》三部细菌内毒素检查法：光度测定法（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定安全性pH《中国药典》三部pH值测定法（通则0631）依据方案而定外观《中国药典》三部溶液颜色检查法（通则0901）、澄清度检查法（通则0902）、可见异物检查法（通则0904）无色澄明/澄清液体其他加帽率《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）≥90.0%《中国药典》四部质谱法（通则0431）-质量研究目的蛋白表达《中国药典》四部高效液相色谱法（通则0512）≥95%基于细胞的转染实验-circRNA原液质量控制宜建立circRNA原液质量控制要求，根据不同的mRNA-LNP制备工艺及研发侧重点选取相应的质量控制指标。外观、PH、细菌内毒素、无菌按照—检测。circRNA纯度、DNA模板残留量、circRNA含量、dsRNA残留量按照.4—.7检测。preRNA、内含子片段、nickedRNA按照3.3—3.5检测。总蛋白残留、工具酶残留如T7RNA聚合酶、序列完整性按照8—.0检测。circRNA序列长度按照《中国药典》通则“0541电泳法”检测。环化接口逆转录反应后，按照Sanger法检测。环化效率按照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”检测。磁珠（如适用）可参照原子吸收光谱法（AAS）或感应耦合等离子体质谱法（ICP-MS）进行检测。有机溶剂按照《中国药典》通则“3200化学残留物测定法”检测。circRNA体外翻译活性使用基于细胞的转染实验。RaseR耐受性酶按照《中国药典》通则“0401紫外-可见分光光度法”检测。质量控制指标汇总见表6。表6circRNA原液质量控制指标汇总表质量属性质量控制指标推荐检测方法参考限值理化性质pH《中国药典》三部pH值测定法（通则0631）依据方案而定外观《中国药典》三部溶液颜色检查法（通则0901）、澄清度检查法（通则0902）、可见异物检查法（通则0904）无色澄明/澄清液体鉴别circRNA序列长度《中国药典》三部电泳法（通则0541）依据方案而定序列完整性《中国药典》三部毛细管电泳法（通则0542）；琼脂糖凝胶电泳依据方案而定RaseR耐受酶《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）-环化接口Sanger法-含量circRNA含量《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）；荧光PCR法；ddPCR法依据方案而定纯度circRNA纯度《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）、毛细管电泳法（通则0542）电泳图谱应显示单一清晰条带，无杂质峰环化效率《中国药典》三部毛细管电泳法（通则0542）-产品相关杂质preRNA《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）；RT-PCR和特异性引物-内含子片段《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）；特异性PCR不可检出nickedRNA《中国药典》四部毛细管电泳法（通则0542）；灵敏的电泳不可检出dsRNA残留量《中国药典》三部免疫化学法（通则3429）；ELISA法-工艺相关杂质总蛋白残留《中国药典》三部蛋白质含量测定法（通则0713）≤1.0%荧光法-工具酶残留如T7RNA聚合酶《中国药典》三部免疫化学法（通则3429）≤0.5μg/mgRNADNA模板残留量《中国药典》三部外源性DNA残留量测定法（3407）<1.0%磁珠（如适用）原子吸收光谱法、感应耦合等离子体质谱法不可检出有机溶剂《中国药典》三部化学残留物测定法（通则3200）-活性circRNA体外翻译活性基于细胞的转染实验依据方案而定安全性无菌《中国药典》三部无菌检测法（通则1101）；ATP生物发光法、固相细胞计数、呼吸作用阴性细菌内毒素《中国药典》三部细菌内毒素检查凝胶法：凝胶限度试验（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定《中国药典》三部细菌内毒素检查法：光度测定法（通则1143）≤20EU/ml，或依据方案而定脂质纳米颗粒Mix配方与mRNA包封/装载及纯化脂质纳米颗粒Mix配方脂质纳米颗粒原材料脂质纳米颗粒原材料的质量可能会对终产品RNA（包含mRNA、circRNA、saRNA）-LNP的粒径与PDI、电荷、包封率、制备及纯化工艺、免疫原性及活性产生重要的影响，宜对脂质原材料进行充分的筛选和质量控制。宜保留LNP各个脂质原材料的选择依据、来源（动物源、植物源；全合成、半合成等）、生产用原材料、生产纯化工艺、特征鉴定、稳定性及杂质等研究资料。杂质研究可考虑在合成或者生产过程中引入的有机溶剂或者重金属残留。多组分及（或）佐剂LNP通常由4个组分组成：可电离脂质、辅助脂质（磷脂）、胆固醇和聚乙二醇化脂质（PEG脂质）；目前国内外部分前沿研究中已经出现5组分LNP及（或）佐剂的添加。对于多出的组分或佐剂，宜重点说明添加的原理，确保不会影响脂质纳米颗粒关键质量指标，宜保留多出组分或佐剂的安全性数据、提高产品药效性能或稳定性的数据等。同时，鉴于mRNA递送系统的复杂性及可能存在的佐剂作用、国内外在研mRNA递送平台的实际情况，宜参照CDE《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》指导要求，不建议添加单独的佐剂成分。如需添加佐剂，应保证添加的佐剂不会引起不可接受的毒性。临床前须通过明确的功能指标及试验研究证实佐剂发挥的具体的免疫调节作用，同时关注添加该佐剂成分后可能引入的风险，如，对mRNA结构、非预期免疫反应及免疫损伤和免疫病理等，对佐剂添加进行全面的药学研究。新型原材料的首次使用遵循国家药品监督管理局药品审评中心《新药用辅料非临床安全性评价指导原则》，对新型脂质材料的作用机制、合成纯化工艺、质量控制、供应商信息、生产批次、安全性、功效性等进行充分研究及阐述。原材料的变更不同生产纯化工艺、不同供应商提供的脂质材料，可能会在纯度、杂质或其他关键质量参数方面有差异。如脂质材料的合成或生产工艺、纯化工艺、供应商等发生变更，宜当对变更后的新材料进行详尽的质量特性研究，确保变更不会对下游工艺及成品产生负面影响。RNA包封/装载及纯化RNA的包封/装载主要是基于微流控或类似技术，将脂质混合物的乙醇溶液RNA酸性溶液快速通过微流控混合器来达到包封的目的。RNA-LNP的纯化、换液、浓缩主要采用切向流过滤，以除去游离的脂质分子，RNA，乙醇等。不同的包封及纯化工艺、缓冲液体系及其它辅助添加剂可能会对RNA-LNP的关键质量指标、功效性、免疫原性、稳定性产生重要影响。宜提交相关资料，说明包封/装载及纯化工艺步骤的合理性以及工艺参数控制范围的合理性。可采用密闭式的生产工艺，以减少生产过程中的暴露环节和储存环节。生产过程中中间产物如需储存，宜开展稳定性研究和相关验证研究，明确储存条件、储存方式包封设备及耗材如采用微流控包封设备来制备RNA-LNP，宜说明包封设备的混合原理、包封设备接触原液的管路的材料种类和性质。LNP包封过程中，通常是在乙醇和酸性缓冲液共存的条件下混合制备，如果包封设备的管路表面为非生物兼容性材料，宜关注包封设备管路表面是否被腐蚀破坏，制备产品是否被污染。微流控芯片推荐使用GMP/FDA认可的卫生级金属材质，如316L。对于使用塑料材料为微流控芯片的LNP包封生产工艺，应当按照国家药品监督管理局药品审评中心发布的《化学药品注射剂生产所用的塑料组件系统相容性研究技术指南（试行）》相关要求，基于风险评估及必要的相容性研究，确认上述塑料芯片组件系统的适用性。对于微流控芯片的质量，应当建立合理的测试方案和指标，确认不同批次微流控芯片间的质量稳定性，以及重复使用芯片每次生产时的芯片质量一致性。生产过程中设备应对此相关指标进行连锁监控，以确保设备在良好的状态下稳定生产。微流控包封设备的输送泵、芯片、阀门、管道管件等部件应当可以进行CIP，以确保所有接触物料的部分均符合LNP生产的GMP要求。微流控包封设备的所有部件（包括芯片）应当能够满足高流速制备工艺产生的系统压力（如≥10MPa的压力），不宜因承压不足而限制单个芯片或单组包封系统的混合流速（生产效率）。生产过程中使用的耗材和容器，如一次性储液袋、移液管路、膜包等，宜具有稳定的物理和化学特性，耗材与直接接触的溶液、生产中间产物等宜有良好的相容性，需结合耗材的材质、使用阶段、供应商提供的研究资料等对其评估或研究。包封/装载工艺参数包封过程中，关键工艺参数包括：各个脂质原材料的摩尔比例、浓度，RNA的浓度，脂质与RNA的投料比例（或氮磷比），缓冲液的盐离子种类、浓度及pH值的；包封混合过程中的流速、混合压力、包封前后废液体积等。采用抗体偶联的LNP，宜考虑制剂过程中的参数与物质对抗体活性的影响。纯化工艺参数纯化过程中，关键工艺参数包括：纯化替换缓冲液的盐离子种类、浓度、pH、跨膜压、流速、中空纤维柱截留分子量、剪切力、除菌过滤等。纳米颗粒质量控制脂质纳米颗粒相关的性能指标包括粒径及分布、电荷、载药浓度与包封率等，建议结合纳米颗粒的制备工艺以及对下游工序与成品的影响程度，对粒径及分布、Zeta电位、RNA浓度及包封率、各个脂质组分的含量、溶剂残留等进行分析研究，并考虑是否作为生产过程控制的一部分或中间产物建立质量控制标准。在选择质量控制方法时，应关注拟表征的质量属性与拟采用的检测方法之间的契合度，保证方法的适用性。mRNA-LNP制剂处方以及工艺制备工艺整体需求制备工艺需要在符合洁净要求的生产车间进行。宜明确mRNA-LNP制造工艺各单元操作要求，按照经过验证和批准后的操作规程的要求进行，并有相关记录。工艺设备符合计量、确认、验证等要求。避免出现偏离工艺规程的偏差，如果出现偏差，宜采取必要措施进行纠正。生产前后宜进行清场和设备的清洁，避免产品间的交叉污染。制备工艺：液体制剂：IVT-mRNA原液→mRNA-LNP脂质包封→超滤浓缩/换液→除菌过滤→DP制剂灌装；冻干制剂：IVT-mRNA原液→mRNA-LNP脂质包封→超滤浓缩/换液→除菌过滤→制剂灌装→冻干→轧盖。mRNA-LNP脂质包封明确脂质组分配比，同时做好各LNP脂质的质量控制工作。包封过程中使用的混合芯片及管路宜使用一次性消耗品，包封设备在使用前后要进行清洁和检测。mRNA-LNP纯化mRNA-LNP的纯化宜去除包封工艺过程中产生的杂质乙醇，将其残留控制在合理的范围之内。mRNA-LNP的纯化过程宜建立合理的中间体质量控制程序，检测和控制LNP的粒径、包封率、mRNA的质量参数等。mRNA-LNP制剂成品分装mRNA-LNP制剂成品在无菌条件下进行分装，分装精度、规格、包材宜经过确认和验证。制剂成品分装宜建立批号管理程序。每批制剂批号唯一，并建立出入库登记制度。制剂成品宜储存在经验证和确认过的合适的储存条件及环境下。circRNA-LNP成品分装成品制剂需按照《药品包装材料与药物相容性试验指导原则》《国家药包材标准》原则开展包材相容性研究。mRNA/cirRNA制剂冻干工艺mRNA/cirRNA制剂在无菌条件下进行灌装，以半压塞的形式转移至冻干机的冻干仓，用已验证过的冻干工艺对样本实施冻干处理，其中含水率宜≤3.0%。冻干制剂储存于经验证和确认的储存条件和环境下，储存温度宜控制在2℃至8℃。mRNA-LNP中间品质量控制宜建立mRNA-LNP中间品质量控制要求，根据不同的mRNA-LNP制备工艺及研发侧重点选取相应的质量控制指标。外观可参照《中国药典》通则“0901溶液颜色检查法”、“0902澄清度检查法”、“0904可见异物检查法”进行检测。微生物限度按照《中国药典》通则“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”检测。mRNA含量可参照《中国药典》通则“0401紫外-可见分光光度法”，或选用《美国药典》“mRNA疫苗质量分析方法-指南草案”RiboGreen荧光检测法（详见附录E），或选用“荧光PCR法”、“ddPCR法”进行检测。包封率可参照《中国药典》指导原则“9014微粒制剂指导原则”，或选用《美国药典》“mRNA疫苗质量分析方法-指南草案”RiboGreen荧光检测法（详见附录E）进行检测。粒径、PDI可参照《纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行）》选取采用动态光散射法（DLS）（详见附录F），或采用显微成像技术[如透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）]、纳米颗粒跟踪分析系统（NTA）、小角X射线散射（SAXS）和小角中子散射（SANS）等也可提供纳米药物粒径大小的信息。其中，SAXS对纳米颗粒粒径的表征方法可参考国际标准化协会发布的ISO17867“ParticlesizeanalysisSmallangleX-rayScattering（SAXS）”。Zeta电位可参照《纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行）》选取采用相分析动态光散射法（PALS）（详见附录F），电泳光散射法（ELS）或可调电阻脉冲感应技术（TRPS）等。质量控制指标汇总见表7。表7mRNA-LNP中间品质量控制指标汇总表质量属性质量控制指标推荐检测方法参考限值理化特性外观《中国药典》三部溶液颜色检查法（通则0901）、澄清度检查法（通则0902）、可见异物检查法（通则0904）乳白色悬浊液粒径动态光散射法、小角X射线散射依据方案而定PDI动态光散射法≤0.2Zeta电位相分析动态光散射法、电泳光散射法依据方案而定有效性指标包封率《中国药典》四部微粒制剂指导原则（9014）；RiboGreen荧光检测法≥80%mRNA含量《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）；RiboGreen荧光检测法、荧光PCR法、ddPCR法依据方案而定安全性微生物限度《中国药典》三部非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）视具体工艺和车间环境mRNA-LNP成品质量控制mRNA-LNP成品质量控制宜建立mRNA-LNP成品质量控制要求，根据不同的mRNA-LNP制备工艺及研发侧重点选取相应的质量控制指标。外观、pH、细菌内毒素、无菌按照—检测。粒径、PDI、Zeta电位按照.5—.6检测。平均粒径可参考《纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行）》选取采用动态光散射法（DLS），按照GB/T29022粒度分析动态光散射法获得平均流体动力学粒径。或参考国际标准化协会发布的ISO17867“ParticlesizeanalysisSmallangleX-rayScattering（SAXS）”。mRNA序列可参照《中国药典》指导原则“9108DNA测序技术指导原则”，或选用sanger法进行检测。mRNA含量可参照《中国药典》通则“0401紫外-可见分光光度法”，或选用《美国药典》“mRNA疫苗质量分析方法-指南草案”RiboGreen荧光检测法（详见附录E），或选用“荧光PCR法”、“ddPCR法”进行检测。包封率可参照《中国药典》指导原则“9014微粒制剂指导原则”，或选用《美国药典》“mRNA疫苗质量分析方法-指南草案”RiboGreen荧光检测法（详见附录E）进行检测。dsRNA残留量可参照《中国药典》通则“3429免疫化学法”，或选用《美国药典》“mRNA疫苗质量分析方法-指南草案”ELSA法（详见附录C）进行检测。加帽率可参照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”、“0431质谱法”检测、“0512高效液相色谱法”进行检测。可见异物按照《中国药典》通则“0904可见异物检查法”检测。不溶性微粒按照《中国药典》通则“0903不溶性微粒检查法”检测。装量/装量差异按照《中国药典》通则“0102注射剂”、“0942最低装量检查法”检测。水分（剂型：冻干粉）按照《中国药典》通则“0832水分测定法-费休氏法”检测。渗透压摩尔浓度按照《中国药典》通则“0632渗透压摩尔浓度测定法”检测。递送系统组分含量可参照《中国药典》通则“0512高效液相色谱法”，或参考《美国药典》“mRNA疫苗质量分析方法-指南草案”使用HPLC-CAD法进行检测。截短序列RNA按照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”检测。加帽不完全的mRNA可参照《中国药典》通则“0542毛细管电泳法”、“0431质谱法”进行检测。去磷酸不完全的mRNA按照《中国药典》通则“0512高效液相色谱法”检测。修饰过度的mRNA按照《中国药典》通则“0512高效液相色谱法”检测。乙醇残留按照《中国药典》通则“0521气相色谱法”检测。异常毒性按照《中国药典》通则“1141异常毒性检查法”检测。蛋白翻译功能可参照ELISA、FACS、WesternBlot进行检测。质量控制指标汇总见表8。表8mRNA-LNP成品质量控制指标汇总表质量属性质量控制指标推荐检测方法参考限值鉴别mRNA序列《中国药典》四部DNA测序技术指导原则（9108）；Sanger法关键元件与理论序列相符含量mRNA含量《中国药典》三部紫外-可见分光光度法（通则0401）；RiboGreen荧光检测法、荧光PCR法、ddPCR法依据方案而定包封率《中国药典》四部微粒制剂指导原则（9014）；RiboGreen荧光检测法≥80%递送系统组分含量《中国药典》三部高效液相色谱法（通则0512）；HPLC-CAD法依据方案而定理化特性平均粒径动态光散射法、小角X射线散射依据方案而定粒径动态光散射法、小角X射线散射依据方案而定PDI动态光散射法≤0.2Zeta电位相分析动态光散射法、电泳光散射法依据方案而定pH《中国药典》三部pH值测定法（通则0631）依据方案而定外观《中国药典》三部溶液颜色检查法（通则0901）、澄清度检查法（通则0902）、可见异物检查法（通则0904）乳白色悬浊液渗透压摩尔浓度《中国药典》三部渗透压摩尔浓度测定法（通则0632）依据方案而定可见异物《中国药典》四部可见异物检查法（通则0904）符合药典规定不溶性微粒《中国药典》四部不溶性微粒检查法（通则0903）符合药典规定装量/装量差异《中国药典》四部注射剂（通则0102）-《中国药典》三部最低装量检查法（通则0942）-水分（剂型：冻干粉）《中国药典》三部水分测定法-费休氏法（通则0832）≤3.0%生物学活性蛋白翻译功能ELISA、FACS、WesternBlot视翻译机理安全性无菌《中国药典》三部无菌检测法（通则1101）；ATP生物发光法、固相细胞计数、呼吸作用阴性